新型抗结核化合物TBI-166在比格犬体内的生物利用度

目的建立比格犬血浆中TBI-166的LC-MS/MS测定方法,研究比格犬口服TBI-166的血浆药代动力学特征和生物利用度。方法比格犬血浆样品中加入TBI-166和内标普萘洛尔后经乙腈沉淀蛋白。HPLC分离采用Symmetry C8（2.1 mm×50 mm,3.5μm）柱,流动相为含0.1%甲酸的乙腈-水,梯度洗脱,流速为0.2 ml/min质谱检测采用电喷雾离子源,正离子选择反应监测（SRM）模式检测m/z 590→478（TBI-166）和m/z 260→183（普萘洛尔,内标）。应用上述LC-MS/MS方法测定比格犬口服TBI-166（3 mg/kg）和静脉注射（0.5 mg/kg）后的血浆药物浓度,用Win Nonlin软件计算药代动力学参数和绝对生物利用度。结果比格犬血浆中TBI-166在2~1000 ng/ml浓度范围内线性关系良好,日内和日间精密度〈10%、回收率〉98.6%、无明显基质效应且血浆样品稳定性好。雌雄比格犬口服TBI-166（3mg/kg）后血药浓度分别于（4.4±3.5）和（1.4±0.5）h达峰,血药峰浓度分别为（122.0±34.6）和（65.4±2.3）ng/ml,AUC（0-t）为（2615.1±1524.4）和（897.2±318.6）h·μg/L。雌雄比格犬静注TBI-166（0.5mg/kg）后t1/2z为（112.9±25.3）和（69.6±35.3）h、CL为（0.3±0.1）和（0.2±0.1）L/（h·kg）、AUC（0-t）为（3222.4±1656.2）和（1798.0±729.2）h·μg/L。雌雄比格犬口服TBI-166生物利用度分别为13.5%和8.3%。结论本研究建立了比格犬血浆中TBI-166的LC-MS/MS测定方法,该方法准确、简便、灵敏。比格犬口服TBI-166后体内消除较慢,具有一定性别差异,生物利用度为8.3%~13.5%。

气相色谱火焰光度法检测TBI-166中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯残留量

目的:建立创新药物E-10-(4-三氟甲氧基苯基)-2,10-二氢-3-(2-甲氧基-3-吡啶)氨基-2-(反-4-甲氧基环己基)亚胺吩嗪(TBI-166)中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯残留量的气相色谱检测方法。方法:采用DB-WAX毛细管色谱柱,柱温为程序升温(起始温度90℃,保持8 min,以6℃·min^(-1)升温至120℃,保持5 min),氮气作为载气,使用火焰光度检测器(FPD)检测。结果:硫酸二甲酯和硫酸二乙酯质量浓度分别在0.048 9~0.977 2μg·mL^(-1)和0.051 0~1.020 0μg·mL^(-1)范围内具有良好的线性,相关系数分别为0.997 2和0.998 0,平均回收率分别为100.1%和99.3%,检测限分别为0.049μg·mL^(-1)和0.020μg·mL^(-1);2批TBI-166原料药中均未检测出硫酸二甲酯和硫酸二乙酯。结论:该法经方法学验证,适用于检测药物中硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的残留。

吡法齐明抗耐药结核分枝杆菌作用机制的初步研究

目的通过测定结核分枝杆菌活性氧含量及过氧化氢酶活性,初步探讨吡法齐明抗耐药结核分枝杆菌的作用机制。方法以1、2、4、8倍于最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的氯法齐明和吡法齐明处理H37Rv标准株24h,应用荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)活性氧检测试剂盒测定不同浓度的氯法齐明和吡法齐明处理前后结核分枝杆菌菌体内的活性氧含量水平变化。以过氧化氢酶活性检测试剂盒测定5株对氯法齐明和吡法齐明均耐药、3株对氯法齐明耐药但对吡法齐明敏感、1株对氯法齐明和吡法齐明均敏感(编号13385)的结核分枝杆菌及H37Rv标准株的过氧化氢酶活性,比较氯法齐明和吡法齐明耐药菌株与敏感菌株的过氧化氢酶活性的差异。采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析,并对吡法齐明药物处理浓度与所测得的荧光强度值进行Spearman相关性分析和线性回归分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果活性氧含量水平测定结果显示,结核分枝杆菌在经不同浓度氯法齐明和吡法齐明处理24h后,各浓度药物处理样本的荧光强度值均值排序分别为1MIC(6668.5)>8MIC(2751.5)>2MIC(2572.0)>4MIC(2015.0),8MIC(2637.5)>4MIC(2297.0)>2MIC(2085.5)>1MIC(1896.0),菌体内积累的活性氧含量均高于无药物刺激的阴性对照样品(H37Rv标准株+DCFH-DA,878.5)至少2倍;且在各浓度吡法齐明处理的菌株中,菌株测定的荧光强度值与药物浓度间呈现明显的正相关(Spearman相关性分析,r=0.976,P<0.001),经线性回归方程检验结果显示回归模型有统计学意义(F=92.576,P=0.011)。菌株过氧化氢酶活性测定结果显示,氯法齐明耐药菌株的过氧化氢酶平均活性(0.87U/10^4cell)是其敏感菌株(0.48U/10^4cell)的近2倍;而吡法齐明耐药菌株的过氧化氢酶活性均值(0.88U/10^4cell)略高于其敏感菌株(0.71U/10^4cell),但与氯法齐明耐药菌株均值相近。结论氯法齐明和吡法齐明作用于结核分枝杆菌后均会引起菌体内活性氧含量的积累,两药可能有着相似的作用机制;过氧化氢酶活性增高可能与结核分枝杆菌对氯法齐明和吡法齐明耐药有关。

吡法齐明抗耐药结核分枝杆菌作用机制的初步研究

目的通过测定结核分枝杆菌活性氧含量及过氧化氢酶活性,初步探讨吡法齐明抗耐药结核分枝杆菌的作用机制。方法以1、2、4、8倍于最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的氯法齐明和吡法齐明处理H37Rv标准株24 h,应用荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)活性氧检测试剂盒测定不同浓度的氯法齐明和吡法齐明处理前后结核分枝杆菌菌体内的活性氧含量水平变化。以过氧化氢酶活性检测试剂盒测定5株对氯法齐明和吡法齐明均耐药、3株对氯法齐明耐药但对吡法齐明敏感、1株对氯法齐明和吡法齐明均敏感(编号13385)的结核分枝杆菌及H37Rv标准株的过氧化氢酶活性,比较氯法齐明和吡法齐明耐药菌株与敏感菌株的过氧化氢酶活性的差异。采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析,并对吡法齐明药物处理浓度与所测得的荧光强度值进行Spearman相关性分析和线性回归分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果活性氧含量水平测定结果显示,结核分枝杆菌在经不同浓度氯法齐明和吡法齐明处理24 h后,各浓度药物处理样本的荧光强度值均值排序分别为1 MIC(6668.5)>8 MIC(2751.5)>2 MIC(2572.0)>4 MIC(2015.0),8 MIC(2637.5)>4 MIC(2297.0)>2 MIC(2085.5)>1 MIC(1896.0),菌体内积累的活性氧含量均高于无药物刺激的阴性对照样品(H37Rv标准株+DCFH-DA,878.5)至少2倍;且在各浓度吡法齐明处理的菌株中,菌株测定的荧光强度值与药物浓度间呈现明显的正相关(Spearman相关性分析,r=0.976,P<0.001),经线性回归方程检验结果显示回归模型有统计学意义(F=92.576,P=0.011)。菌株过氧化氢酶活性测定结果显示,氯法齐明耐药菌株的过氧化氢酶平均活性(0.87 U/10^4cell)是其敏感菌株(0.48 U/10^4cell)的近2倍;而吡法齐明耐药菌株的过氧化氢酶活性均值(0.88 U/10^4cell)略高于其敏感菌株(0.71 U/10^4cell),但与氯法齐明耐药菌株均值相近。结论氯法齐明和吡法齐明作用于结核分枝杆菌后均会引起菌体内活性氧含量的积累,两药可能有着相似的作用机制;过氧化氢酶活性增高可能与结核分枝杆菌对氯法齐明和吡法齐明耐药有关。

抗耐药结核病新药吡法齐明通过醌氧化还原酶介导发挥作用的机制研究

目的对吡法齐明(pyrifazimine,TBI-166)通过醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase,QOR)介导累积活性氧(reactive oxygen species,ROS)发挥抗结核作用的机制进行探索。方法表达、纯化MtbQOR蛋白,设置空白对照组及加TBI-166(0.03、0.3、3μg/ml)组,酶标仪监测波长340nm处吸光度(A_(340 nm))下NADPH的下降程度(ΔA);应用辅酶ⅡNADP(H)含量检测试剂盒检测不同浓度TBI-166作用H37Rv菌体后NADPH/NADP+的比值;应用细菌活性氧检测试剂盒检测结核分枝杆菌H37Rv标准株和临床分离株菌体内ROS荧光值。结果空白对照组ΔA(0.316±0.032)较0.03、0.3、3μg/ml TBI-166组(0.506±0.107、0.531±0.054、0.801±0.079)明显降低,差异有统计学意义(t=-3.799,P<0.05;t=-7.634,P<0.01;t=-12.683,P<0.01)。在48h内,加TBI-166组NADPH/NADP+比值(0.847±0.229)低于空白对照组比值(1.728±0.384)。H37Rv菌株中,TBI-166刺激组ROS荧光值(23072±2584)明显高于空白对照组(8282±448),差异有统计学意义(F=33.334,P<0.01)。在菌株号为12897菌株中,TBI-166刺激组ROS荧光值(18369±3118)明显高于空白对照组(12268±2735),差异有统计学意义(F=5.026,P<0.05);在菌株号为15171菌株中,3μg/ml TBI-166刺激组ROS荧光值(17572±249)明显高于空白对照组(11109±343),差异有统计学意义(F=122.601,P<0.01);在菌株号为11492及11195菌株中,TBI-166刺激组与空白对照组ROS荧光值差异无统计学意义(F=161.440,P>0.05;F=44.788,P>0.05)。结论TBI-166可以通过增加MtbQOR介导的氧化还原反应,降低NADPH/NADP+的比值,刺激菌体累积ROS发挥抗结核作用。

抗耐药结核病新药吡法齐明通过醌氧化还原酶介导发挥作用的机制研究

目的对批法齐明(pyrifazimine,TBI-166)通过醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase,QOR)介导累积活性氧(reactive oxygen species,ROS)发挥抗结核作用的机制进行探索。方法表达、纯化MtbQOR蛋白,设置空白对照组及加TBI-166(0.03、0.3、3μg/ml)组,酶标仪监测波长340 nm处吸光度(A_(340nm))下NADPH的下降程度(△A);应用辅酶ⅡNADP(H)含量检测试剂盒检测不同浓度TBI-166作用H37Rv菌体后NADPH/NADP+的比值;应用细菌活性氧检测试剂盒检测结核分枝杆菌H37Rv标准株和临床分离株菌体内ROS荧光值。结果空白对照组△A(0.316±0.032)较0.03、0.3、3μg/ml TBI-166组(0.506±0.107、0.531±0.054、0.801±0.079)明显降低,差异有统计学意义(t=-3.799,P<0.05;t=-7.634,P<0.01;t=-12.683,P<0.01)。在48h内,加TBI-166组NADPH/NADP^(+)比值(0.847±0.229)低于空白对照组比值(1.728±0.384)。H37Rv菌株中,TBI-166刺激组ROS荧光值(23072±2584)明显高于空白对照组(8282±448),差异有统计学意义(F=33.334,P<O.O1)。在菌株号为12897菌株中,TBI-166刺激组ROS荧光值(18369±3118)明显高于空白对照组(12268±2735),差异有统计学意义(F=5.026,P<0.05);在菌株号为15171菌株中,3μg/ml TBI-166刺激组ROS荧光值(17572±249)明显高于空白对照组(11109±343),差异有统计学意义(F=122.601,P<0.01);在菌株号为11492及11195菌株中,TBI-166刺激组与空白对照组ROS荧光值差异无统计学意义(F=161.440,P>0.05;F=44.788,0.05).结论TBI-166可以通过增加MtbQOR介导的氧化还原反应,降低NADPH/NADP^(+)的比值,刺激菌体累积ROS发挥抗结核作用。

抗结核新药吡法齐明组合用药的体外及小鼠体内抗结核活性研究

目的评价吡法齐明(pyrifazimine,TBI-166)与抗耐药结核病A组药物贝达喹啉(bedaquiline,BDQ)、莫西沙星(moxifloxacin,MFX)及新型抗结核药物德拉马尼(delamanid,DLM)、SQ109、Q203、PBTZ169两药组合在体外及小鼠体内的抗结核活性,为TBI-166联合用药提供依据。方法本研究自2020年9月至2021年7月。应用棋盘法测定TBI-166与BDQ、MFX、DLM、SQ109、PBTZ169两药组合的相互作用,时间杀菌曲线法评估具有部分协同作用的两药组合的抗结核活性;BALB/c小鼠急性结核病模型评价两药联用组(TBI-166+BDQ、TBI-166+SQ109、TBI-166+PBTZ169、TBI-166+Q203)与单药组(TBI-166、BDQ、SQ109、PBTZ169、Q203)治疗4和8周的抗结核活性,采用独立样本t检验进行数据分析。结果 TBI-166与抗结核药物联用后,最低药物浓度(MIC)降至应用单药的6.25%~25.00%,TBI-166分别与BDQ、SQ109、PBTZ169两药联用后,部分抑制浓度指数(FICI)值分别为0.56、0.75、0.75;时间杀菌实验显示TBI-166分别与BDQ、SQ109、PBTZ169两药组合作用于结核分枝杆菌14 d后与单药应用时相比活菌量减少了至少3 log10 CFU/ml;在小鼠实验中发现BDQ、SQ109和PBTZ169分别与TBI-166组合后与单药组相比肺组织活菌量较少,其中TBI-166+BDQ组小鼠在治疗4周后肺组织培养阴性,小鼠肺内活菌数比BDQ单药组低1.49 log10CFU(P<0.01)。结论体外及小鼠体内实验揭示TBI-166分别与BDQ、SQ109、PBTZ169联用后均具有协同抗结核活性。