侵染西番莲的东亚西番莲病毒全基因组序列特征及TC-RT-PCR检测技术

【目的】东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)是西番莲(百香果)上危害严重的一种病毒。本研究对我国大陆地区东亚西番莲病毒福建分离物(EAPV-FJ)的全基因组序列进行测定,明确其基因组序列特征,并建立适用于EAPV特异性检测的TC-RT-PCR(tube capture RT-PCR)技术,旨在为该病毒的检测、监测及防治提供理论依据和技术支持。【方法】采用小RNA深度测序技术结合分段克隆方法和RACE技术,测定EAPV-FJ的全基因组序列,对获得的序列进行序列特征、系统发育关系和重组分析;通过反应条件及反应体系优化,建立用于EAPV快速检测的TC-RT-PCR技术,测定其特异性和灵敏度,并应用建立的TC-RT-PCR技术对福建省西番莲果园采集的样品进行检测,同时利用普通RT-PCR检测方法进行验证。【结果】测序获得的EAPV-FJ核苷酸序列全长为10065 nt(不含polyA尾),含有一个长度为9663 nt的开放阅读框,编码3220 aa的多聚蛋白(polyprotein),经剪切后最终生成P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP 10个蛋白。基因组序列一致性分析结果表明,EAPV-FJ全基因组与GenBank登录的4个EAPV代表分离物核苷酸序列一致性为80%—99%,其中与AO株系的越南分离物EAPV-GL1(GenBank登录号:MT450870)一致性最高,为99%;EAPV-FJ多聚蛋白核苷酸、氨基酸序列与GenBank登录的4个EAPV代表分离物一致性分别为79%—99%、82%—98%。基于多聚蛋白核苷酸序列的系统发育关系分析显示,EAPV分离物共分为两个类群(Group I为AO株系、GroupⅡ为IB株系),未表现出明显的地理相关性,其中EAPV-FJ属于Group I,与已报道的越南分离物EAPV-GL1亲缘关系最近。重组分析结果表明,EAPV-FJ为非重组分离物。建立的TC-RT-PCR检测技术具有较好的特异性和灵敏度,仅能检测到感染EAPV的西番莲样品,而黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、西番莲潜隐病毒(Passiflora latent virus,PLV)、木槿潜隐皮尔斯堡病毒(hibiscus latent Fort Pierce virus,HLFPV)、芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV)、大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)、夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV)等其他病毒及健康样品均无法检测到;灵敏度最低可以检测到稀释10倍的EAPV西番莲病叶提取液原液,与普通RT-PCR检测方法的灵敏度相当。应用建立的TC-RT-PCR技术从福建省西番莲果园采集的60份疑似病样中检出EAPV共13份,该结果与普通RT-PCR检测结果一致。【结论】首次报道了我国大陆地区EAPV全基因组序列,该分离物(EAPV-FJ)基因组结构与已报道的其他分离物一致,在系统发育关系上与越南分离物EAPV-GL1亲缘关系最近,且未检测到重组位点;建立的TC-RT-PCR检测技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高和成本低的优点,能有效用于西番莲果园样品上EAPV的实际检测。

TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国重要的检疫性有害生物,BPMV传入的风险随大豆进境数量增多而加大。本文针对菜豆荚斑驳病毒,以大豆种子提取液为材料,分别建立了TaqMan-MGB荧光定量IC-RTPCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR快速检测方法。根据GenBank公布的BPMV外壳蛋白基因序列,选择其保守区域,设计1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,测定了TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR方法的特异性和灵敏度,并将TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR、TaqMan-MGB荧光定量TC-RTPCR、IC-RT-PCR和TC-RT-PCR 4种检测方法的灵敏度进行比较。结果表明:所建立的两种检测方法特异性良好;TCRT-PCR的灵敏度为10-1倍病毒提取液原液;IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR灵敏度相当,为10-3倍病毒提取液原液;TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR灵敏度最高,为10-5倍病毒提取液原液,是IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR检测方法的102倍,是TC-RT-PCR检测方法的104倍;两种检测方法均能较好应用于实际大豆样品的检测。本文所建立的TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测方法利用抗原特异性或试管非特异性捕捉病毒粒子,无需提取RNA,为进境大豆种子上BPMV的检测提供了稳定、快速、简便的技术依据,其较高的灵敏度和特异性具有较好的应用价值。

基于TC-RT-PCR方法的几种烟草主要病毒病的多重检测体系的构建

为避开病毒病检测中分子生物学方法检测时RNA提取这一复杂费时费力的过程,且能在同一个反应中同时检测多种病毒病,使大量病毒病样品和多种病毒病复合侵染的检测更简单、快捷。对我国常见的3种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,通过优化反应条件,摸索扩增参数构建多重TC-RTPCR检测体系。结果表明:首次成功构建能同时检测TMV、CMV和PVY的多重TC-RT-PCR检测体系。该技术无需RNA的提取,包括叶片研磨、捕捉、反转录、PCR扩增和电泳检测等步骤,简单快捷、省时省力,具有高效性、系统性和经济简便性等特点。

检测砂梨潜隐病毒的IC-RT-PCR和TC-RT-PCR的研究

以砂梨为试材,在生物学和血清学检测的基础上,采用免疫捕作RT-PCR穴IC-RT-PCR雪和试管捕作RT-PCR穴TC-RT-PCR雪技术,对苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)进行了检测分析。结果表明,TC/IC-RT-PCR均能有效检测梨粗提液中的ACLSV和ASGV,分别获得了大小约358bp和499bp的目标扩增片段;但IC-RT-PCR检测ACLSV的效果受到病毒分离株间血清学关系影响。与传统的RT-PCR相比,IC/TC-RT-PCR不仅灵敏度更高,而且不需提取总RNA,可以简化操作程序和减少苯酚、氯仿类有机试剂对人体的伤害和对环境的污染,适合于大量梨样品的病毒快速灵敏检测。

TC-RT-PCR技术在马铃薯病毒检测及其基因克隆上的应用

利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)技术从马铃薯病毒发病叶片中检测并克隆到PVX、PVY和PLRV3种病毒及其外壳蛋白基因的全长序列,长度分别为714、804和627 bp。结果表明,TC-RT-PCR技术是一种简单,快捷,灵敏度高的方法,在马铃薯病毒的检测和相关基因的克隆中将会得到很好的应用。

TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒的研究

根据已报道的菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列设计特异性引物,应用试管捕捉RT-PCR(Tube capture RT-PCR,TC-RT-PCR)技术对大豆种皮上的BPMV进行检测。结果表明,TC-RT-PCR方法能从携带BPMV的大豆种皮上扩增到预期大小的基因片段。将TC-RT-PCR扩增产物克隆测序后进行序列分析,结果显示扩增到的片段序列与BPMV的CP基因序列具有高度同源性,进一步证实了该方法的准确性。应用TC-RT-PCR方法,成功检测了一批进境大豆样品。本文建立的TC-RT-PCR方法,为大豆种子上BPMV的检测和诊断提供了一种新的参考方法。

砂梨上苹果茎痘病毒的调查分析及RT-PCR与TC-RT-PCR检测研究

试验通过西方烟(Nicotianaoccidentalis‘37B’)和杂种(Pyroniaveitchii)、A20接种鉴定及PAS-ELISA检测,对保存于国家砂梨种质资源圃的38份砂梨样品进行了苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)带毒率的调查分折。结果表明,生物学鉴定与血清学检测结果一致,ASPV带毒率均为26.3%。应用以dsRNA为模板RT-PCR检测该病毒,在杂种和A20上显症的6个样品均获得316bp目标片段。应用TC-RT-PCR检测显症的西方烟,也获得了预期的目标片段。

库尔勒香梨上苹果茎沟病毒的三种分子生物学检测技术比较研究

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、试管捕捉反转录聚合酶链式反应(TC-RT-PCR)及免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)技术对20份库尔勒香梨样品进行苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)检测,结果显示RT-PCR检测出7份样品感染ASGV,再使用TC-RT-PCR与IC-RT-PCR进行复检,有6份样品检测到ASGV,说明TCRT-PCR与IC-RT-PCR不如RT-PCR的灵敏度高,但是TC-RT-PCR与IC-RT-PCR不需要提取总RNA,操作简便,且减少有毒有机溶剂的危害与污染。TC-RT-PCR与IC-RT-PCR相比,检测得到的特异性带较清晰。

贵州烟草病毒病的主要种类及分布特点

为弄清贵州主要烟草病毒病种类及分布情况,采用TC-RT-PCR检测方法,对从贵州五大烟区15个采样点采集的330份烟草病毒样品进行了检测。结果表明:贵州有烟草病毒病12种,分别为烟草普通花叶病毒病(TMV)、黄瓜花叶病毒病(CMV)、马铃薯Y病毒病(PVY)、马铃薯X病毒病(PVX)、烟草线条病毒病(TEV)、烟草蚀纹病毒病(TSV)、烟草脆裂病毒病(TRV)、烟草环斑病毒病(TRSV)、烟草曲叶病毒病(TLCV)、烟草轻绿花叶病毒病(TMGMV)、番茄斑萎病毒病(ToSWV)和烟草脉带花叶病毒病(TVBMV)。TMV和PVY几乎分布于所有的烟草种植区;CMV、TEV和TSV在5个县以上均有分布;而贵定、平坝和威宁县分布的病毒病种类较多,各分布有6种。

温胆汤对高脂血症大鼠脂质代谢的影响

目的 :探讨温胆汤对高脂血症大鼠低密度脂蛋白受体基因表达的影响。方法 :在建立大鼠高脂血症模型基础上 ,观察温胆汤对大鼠血脂水平、总脂解酶 (LA)、脂蛋白脂酶 (LPL)和肝脂酶 (HL)活性以及肝脏低密度脂蛋白受体 (LDLR)基因表达的影响。结果 :温胆汤能显著抑制高脂模型大鼠血清总胆固醇 (TC)、血清总甘油三酯 (TG)浓度 ,提高LPL和LA活性 ,但对HL活性无明显影响 ;逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)实验显示高脂模型大鼠肝脏LDLRmRNA表达降低 ,温胆汤能显著上调高脂血症大鼠肝脏LDLRmRNA水平。结论 :温胆汤可能通过调节大鼠肝脏LDLR转录水平预防脂质代谢紊乱。

温胆汤对高脂血症大鼠及小鼠体内脂质代谢调节机理研究

目的 :探求温胆汤对实验动物体内脂质代谢调节作用的机理。方法 :采用腹腔注射蛋黄乳剂的方法建立急性高脂血症小鼠模型 ,观察温胆汤对急性高脂血症成年小鼠粪便脂质含量、血清总胆固醇 (TC)、血清总甘油三酯 (TG)、低密度胆固醇 (LDL c)含量、血清丙二醛 (MDA)含量、血清超氧化物歧化酶 (SOD)活性、肝脏总脂解酶(LA)活性、脂蛋白脂肪酶 (LPL)活性和肝脂酶 (HL)活性的影响 ;建立大鼠高脂血症模型 ,观察温胆汤对大鼠血脂(TC、TG)水平、总脂解酶 (LA)、脂蛋白脂酶 (LPL)和肝脂酶 (HL)活性 ,以及肝脏低密度脂蛋白受体 (LDLR)基因表达的影响。结果 :温胆汤可降低小鼠粪便脂质含量 ,显著降低急性高脂血症小鼠血清TC、TG、LDL c含量 (P <0 .0 5 ) ,温胆汤还可提高血清SOD活性 ,降低MDA含量 ,达到降低体内脂质过氧化程度的目的。同时 ,温胆汤可提高肝脏脂蛋白脂肪酶 (LPL)活性和肝脏总脂解酶 (LA) ,但对肝脂酶 (HL)活性无明显影响。在针对高脂血症大鼠的实验研究中发现 ,温胆汤能够显著抑制大鼠血清总胆固醇 (TC)、血清总甘油三酯 (TG)浓度 ,提高脂蛋白脂酶(LPL)和总脂解酶 (LA)活性 ,但对肝脂酶 (HL)活性无明显影响 ;逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)实验显示高脂饲料能显著降低大鼠肝脏LDLRmRNA水平 ,温胆汤能显?

重组天花粉蛋白的原核表达纯化和免疫原性分析

目的构建携带天花粉蛋白基因的高效表达载体,对比原核表达的重组天花粉蛋白和天然蛋白的免疫原性。方法通过RT-PCR技术扩增无N端和C端序列的TCS基因,测序鉴定后克隆入表达载体pET-29b中,IPTG诱导表达。用金属螯合层析法纯化重组蛋白。薄层扫描及Bradford法检测纯化后重组蛋白的纯度和含量。间接ELISA法检测重组蛋白和天然蛋白产生的多克隆抗体效价。Western blotting检测重组蛋白与抗天然蛋白抗体之间的免疫反应性。结果1.双酶切鉴定结果表明,pET-29b-TCS成功构建;2.30℃,1 mmol/L的IPTG诱导4 h,重组蛋白的表达量最高(占细菌总蛋白量的36%),主要以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中;3.His-tag特异性结合树脂纯化后,获得了纯度达95%的重组蛋白,纯化后的蛋白含量为1.2 g/L;4.间接ELISA法检测天然蛋白和重组蛋白产生的抗体效价分别为1∶4 960和1∶5 120;5.Western blotting测纯化的重组蛋白与抗天然蛋白的多克隆抗体之间有特异反应性。结论本实验成功构建了高效表达载体pET-29b-TCS,携带的天花粉蛋白基因无N端和C端编码序列。重组蛋白的抗体效价显著低于天然蛋白,表明天然蛋白的糖基化与其免疫原性之间有一定的关系。