维持液pH值、血清对犬瘟热病毒和犬细小病毒TCID50检测的影响

在进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)的TCID50检测时,采用不同pH值维持液(pH值7.0和7.4)及血清含量(0和2%),于37℃、含5%二氧化碳的培养箱中培养5 d之后判定结果,分析维持液pH值和血清含量对检测结果的影响。结果表明,pH值7.0和pH值7.4的维持液对CDV和CPV检测结果无明显影响。不同血清含量维持液对检测结果有一定影响,其中,对CDV的TCID50检测,含2%血清的维持液的检测结果高于无血清的,检测时应使用含2%血清的维持液进行检测;对CPV的TCID50检测,含2%血清的维持液和无血清维持液的检测结果完全一致,表明检测时两种血清含量的维持液皆可使用。

核酸杂交技术在禽白血病病毒TCID_(50)测定中的应用

为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分按照试剂盒说明书进行p27抗原的ELISA检测,另一部分提取RNA后以鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒进行Dot-blot检测,每孔中细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体进行IFA检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算三种方法测定的TCID50。结果显示ELISA法、IFA法和Dot-blot法在确定病毒感染中能够相互验证和补充,该病毒在CEF的TCID50分别为10-4.7TCID50/0.1 m L、10-5.2TCID50/0.1 m L和10-5.3TCID50/0.1 m L。表明采用Dot-blot法测定ALV-J的TCID50是可行的,不仅能够排除内源性的干扰,并且比ELISA和IFA具有更高的灵敏度。

BHK-21细胞稳定测定猪乙型脑炎病毒半数细胞感染量效价(TCID_(50))的条件优化及应用

为建立BHK-21细胞测定乙型脑炎病毒(Japenese encephalitis virus,JEV)病毒效价的方法,对96孔细胞板中不同初始接种量BHK-21细胞在多种维持液中的生长状态进行探讨,发现当BHK-21细胞以1250～2500个/孔接种96孔板培养24 h后,更换含3%新生牛血清的DMEM后在37℃、5%CO2条件下可至少良好维持72～96 h。在此条件下并基于Reed-Muench法测定病毒效价的原理,本文建立了准确测定JEV TCID50的方法,利用该方法对JEV野毒分离株及商品疫苗进行测定,均获得稳定、准确的病毒效价。本实验为JEV的体外培养、病毒定量、疫苗评价等提供了一种准确、稳定、易判定的参考方法。

鸽新城疫病毒毒价的血凝价、ELD_(50)和TCID_(50)值相关性比较

本文比较了用血凝反应（ＨＡ），在鸡胚成纤维细胞上的ＴＣＩＤ５０及用发育鸡胚做ＥＬＤ５０来测定鸽新城疫病毒（ＮＤＶ）毒价的相关性。结果表明，鸽ＮＤＶ毒价的ＴＣＩＤ５０和ＥＬＤ５０的值基本相同。ＨＡ滴度虽然与ＴＣＩＤ５０值有一定的相关性，但远不如ＴＣＩＤ５０准确。接种病毒后死亡鸡胚的新鲜尿囊液经冻融后，其中鸽ＮＤＶ的ＨＡ滴度和ＴＣＩＤ５０均逐渐下降。每经一次冻融，毒价几乎减少５０％。

用微量细胞培养ELISA测定HCLV TCID_(50)

应用猪瘟兔化弱毒制备的猪瘟兔化疫苗常因为剂量不足而引起免疫失败。究其原因主要是因为兔检(RID)合格的猪瘟兔化苗批间差异较大,质量不稳定。为此建立微量细胞培养ELISA用以测定HCLV TCID50,并获得成功,可以替代RID测毒。

基于两种动物模型测定猪伪狂犬病病毒LD_(50)与TCID_(50)比较研究

伪狂犬病活疫苗作为一种安全有效、全国广泛推广使用的疫苗,其效力检验十分必要,而伪狂犬强毒毒价测定则是效力检验的一个必要前提。本实验选用BHK-21细胞及家兔和小鼠实验动物,来检测PRV的TCID50和LD50,旨在找出基于家兔和小鼠两种实验动物PRVTCID50和LD50之间的关系,以简化该苗的效力检验过程。结果表明:用兔子做效力检验时,可以用TCID50代替测LD50。

猪繁殖与呼吸综合征病毒TCID_(50)的测定

本文建立一种测定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)滴度的新方法-免疫染色法。用免疫染色法测得病毒在Mark-145细胞系上的滴度为105.8TCID50/0.1ml,常规法测得病毒滴度为105.2FCID50/0.1ml,这表明前者敏感性和准确率高于后者。

鸡痘病毒TCID_(50)和EID_(50)值相关性分析

鸡痘是鸡痘病毒（Fowlpoxvirus，FPV）引起的一种急性接触性传染病，各年龄和品种的鸡都易感染，但雏鸡的敏感性最高。鸡痘可使病禽生长迟缓，产蛋下降，种禽发病时孵化率降低，若并发其他传染病、寄生虫病和卫生条件、营养状况不良时也可以引起大批死亡，特别是雏鸡损失更为严重，死亡率高达50％。

B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株的TCID_(50)与p27抗原之间的相关性研究

为了研究B亚群禽白血病病毒(ALV-B)的半数细胞培养物感染量(TCID50)与p27抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)的S/P值之间的相关性,本试验将ALV-B SDAU09C2株接种鸡胚成纤维细胞(CEF细胞),换维持液后连续10d取样,检测10d的TCID50值与p27抗原的S/P值之间的相关性;同时,将该毒株在DF-1细胞系上传代至20代,取其中的第1、5、10、15和20代分别进行TCID50滴度的测定和p27抗原检测。结果表明,在CEF细胞上接种的ALV-B SDAU09C2株连续10d的TCID50值与p27抗原之间存在显著的正相关(r=0.94002;P<0.0001);在DF-1细胞系上传的不同代数之间也呈显著正相关(r=0.96449;P=0.0080)。由此可推测ALV-B的TCID50与p27抗原呈显著正相关,可以用ELISA法测得的p27抗原的S/P值来估测病毒的TCID50值。

用转化BHK-21细胞测定口蹄疫A、O和Asia-Ⅰ型病毒TCID_(50)与LD_(50)毒价对比试验

目前,我国口蹄疫疫苗生产和检验依然采用乳鼠测毒法,经生产实践证明该检验方法较为繁琐,费时费力,严重影响了检验效率。本实验室前两年用正常的BHK-21细胞测定TCID50,结果由于普通BHK-21细胞在达到判定时间的时候,大量细胞已老化脱落,造成后期染色结果不准确,与乳鼠测毒法结果差异较大。后来又引进了转化BHK-21细胞,专用于检测口蹄疫病毒,经试验证明与乳鼠测毒法取得了较为一致的检验结果,经证明用转化BHK-21细胞测定TCID50是可行的,是一种省时省力的好方法。

用96孔微量板代替小八角瓶培养BTC测定山羊痘细胞弱毒TCID_(50)的试验

用96孔微量板代替小八角瓶培养犊牛睾丸细胞(BTC)测定山羊痘细胞弱毒的TCID50。试验结果表明,通过对2种方法比较得出96孔微量板检测山羊痘细胞弱毒TCID50比八角瓶法具有操作简单、重复性好、容易观察等优点。

用一步法和两步法测定口蹄疫病毒TCID_(50)的比较试验

分别用一步法和两步法测定50批病毒液的TCID50,经Bland-Altman法分析得出,2种方法有较好的一致性。试验结果表明,用一步法与两步法测定口蹄疫病毒时,其TCID50测定结果一致。

猪繁殖与呼吸综合征病毒超滤浓缩对其TCID_(50)的影响

采用Millipore公司的Mini pellicon超滤系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒液进行了浓缩试验,膜堆(PES)的分子量分别为5,8,10,30和50 ku。结果显示,不同孔径的膜堆其浓缩抗原液的TCID50皆随浓缩倍数逐步上升,透过液的TCID50全部为0,截留率为100%。表明采用浓缩工艺对PRRSV细胞培养液进行适当浓缩,可有效提高抗原浓度。

Determination of 50% endpoint titer using a simple formula

Two commonly used methods for calculating 50% endpoint using serial dilutions are Spearman-Karber method and Reed and Muench method. To understand/apply the above formulas, moderate statistical/mathematical skills are necessary. In this paper, a simple formula/method for calculating 50% endpoints has been proposed. The formula yields essentially similar results as those of the SpearmanKarber method. The formula has been rigorously evaluated with several samples.

空心莲子草醇提物抗AIV-H9N2作用的研究

为了研究空心莲子草醇提物[Alternanthera philoxeroides(Mart.)Griseb.alcohol extract,AAE]的体外抗H9N2型禽流感病毒(avian Influenza virus,AIV)的效果,探索空心莲子草体外抗病毒的作用方式,试验测定了AIV-H9N2对DF-1细胞的TCID50;采用观察细胞病变联合CCK-8检测的方法,测定AAE对DF-1细胞的毒性作用;通过计算各试验组(空白对照组、病毒对照组、给药组)细胞的存活率,观察3种作用方式(预防感染作用、抑制复制作用及直接杀灭病毒作用)下,不同浓度AAE体外抗AIV-H9N2的效果,并计算治疗指数(TI)。经尿囊腔接种病毒,测定鸡胚的半数胚致死量(ELD50),测定AAE对鸡胚的最大安全浓度,然后对鸡胚进行攻毒用药试验,统计各组存活情况及血凝效价,观察胚体的发育情况。结果表明:收获的AIV-H9N2病毒液TCID50为1×10^(-4.23)/0.1 mL;AAE对DF-1细胞作用24,48小时时的CC50浓度分别为(191.52±8.73)μg/mL、(156.96±8.79)μg/mL;3种作用方式下,药物对细胞的保护率范围分别在40%~58%、4%~34%及12%~18%之间,AAE治疗指数预防病毒感染作用(3.42±0.71)大于影响病毒复制作用(1.74±0.11),AAE不具有直接杀灭病毒作用。鸡胚的ELD50为1×10^(-2.84)/0.2 mL,AAE对鸡胚的最大安全浓度为32.5 mg/mL,AAE能显著改善AIV-H9N2感染胚胎的存活情况(P<0.05),降低病毒感染的血凝效价,减弱病毒对胚体发育的影响。说明AAE在DF-1细胞和鸡胚中对AIV-H9N2具有潜在的抑制作用,可以抑制AIV-H9N2的活性。

猪圆环病毒2型陕西杨凌株的分离鉴定及全基因组分析

【目的】分离得到猪圆环病毒2型(PCV-2)陕西杨凌株,测定病毒滴度(TCID50),并进行全基因组序列比对,为研制针对性更强的PCV-2疫苗提供理论依据。【方法】从经PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料中,分离病毒并接种PK-15细胞,通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察,对分离病毒进行鉴定;用免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA),测定分离毒株的TCID50,并对其全基因组序列进行测定与分析。【结果】分离得到1株猪圆环病毒2型毒株,分离株在PK-15细胞上的TCID50为10-4.75。全基因组序列同源性比对发现,分离株与一加拿大分离株(DQ200735)同源性最高(99.4%)。【结论】从陕西杨凌分离得到了1个猪圆环病毒2型分离株。

敲减单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)UL30蛋白表达可抑制HSV-2复制

按照shRNA(small hairpin RNA)设计要求,选择编码单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶催化亚单位的UL30(unique long 30,UL30)基因序列保守区域,设计、合成并构建表达UL30序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pUL30.通过磷酸钙转染法将其转染入HEK(human embryonic kidney)293细胞中,用蛋白印迹法检测对HSV-2 UL30蛋白表达的影响,观察受染细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),终点滴定法测定细胞上清液中病毒感染滴度(50%tissue culture infective dose,TCID50).结果表明,针对UL30基因的siRNA能有效抑制UL30蛋白表达,同时显著抑制受染细胞的CPE,降低上清液中病毒感染滴度.提示本研究建立的针对UL30基因特异性siRNA能有效阻断HSV-2在HEK293细胞内的复制,UL30基因是一个潜在的抗HSV-2复制的药物靶标.

J亚群禽白血病病毒NX0101株的TCID_(50)与p27抗原之间的相关性研究

为了研究J亚群禽白血病病毒在细胞上接种后的半数细胞培养物感染量(TCID_(50))与p27抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)的S/P值之间的相关性,并探讨其意义。本试验将J亚群禽白血病病毒NX0101株接种鸡胚成纤维细胞(CEF细胞),换维持液后连续10d取样,检测10d的TCID_(50)值与p27抗原的S/P值之间的相关性。同时,将该毒株在DF-1细胞系上传代至20代,取其中的第1代、第5代、第10代、第15代和第20代分别进行TCID_(50)滴度的测定和p27抗原检测。结果表明:在CEF细胞上接种的NX0101株J亚群禽白血病病毒连续10d的TCID_(50)值与p27抗原之间存在显著的相关性(r=0.85277;P<0.0001)呈正相关;在DF-1细胞系上传的不同代数之间也呈显著正相关(r=0.93000;P=0.0220)。由此可以推测J亚群禽白血病病毒的TCID_(50)与p27抗原呈显著正相关,因而可以用ELISA法测得的p27抗原的S/P值对病毒的TCID_(50)值进行估测。

禽腺病毒江苏分离株的细胞培养特性

为进一步研究的生物学特性,应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肾细胞(CEK)培养禽腺病毒江苏分离株,进行培养特性、血凝特性、理化特性、超薄切片观察和PCR检测。实验结果表明,CEF感染病毒后没有出现病变。CEK感染病毒后则表现出很强的聚集性并形成细胞团,有的成束状,最后脱落;ReedMuench方法测得其TCID50为每0.1mL10-5.4。CEK核内存在大量70～80nm、呈典型的晶格状排列的腺病毒颗粒。