TDZD-8缓解奥沙利铂诱导的神经痛

目的 探究糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3 beta, GSK-3β)抑制剂TDZD-8对化疗药物奥沙利铂副作用引起神经疼痛的作用及机制。方法 连续5 d腹腔注射奥沙利铂建立大鼠神经病理性疼痛模型;鞘内注射TDZD-8进行给药;自发性缩足反射和机械痛阈值检测大鼠疼痛行为学变化;免疫荧光和免疫印迹检测脊髓炎症及组织蛋白水平变化。结果 鞘内给药TDZD-8明显缓解奥沙利铂诱发大鼠的痛觉过敏;TDZD-8给药明显抑制脊髓小胶质细胞激活及炎症反应;TDZD-8给药明显抑制GSK-3β激活。结论 TDZD-8阻断GSK-3β活性,降低NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NOD-, LRR-, and pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎症小体介导的脊髓炎症缓解神经痛。

TDZD-8对新生大鼠背根节神经元轴突再生影响的体外实验研究

目的:探讨葡萄糖原合成酶-3β(glycogen synthase kinase3β,GSK-3β)的抑制剂TDZD-8对新生大鼠背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元轴突生长和延长的影响。方法:取新生(<5d)SD大鼠胸腰段背根节进行原代培养、提纯和鉴定。用WD法制成健康成年雌性SD大鼠T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型,造模7d后取T8～T10节段脊髓制作脊髓提取液。将不同浓度TDZD-8与成年大鼠脊髓提取液和新生大鼠DRG神经元分组培养:A组,DRG神经元+磷酸缓冲液(phosphate-bufered saline,PBS);B组,DRG神经元+正常脊髓提取液;C组,DRG神经元+假手术脊髓提取液;D组,DRG神经元+全瘫脊髓提取液;E组,DRG神经元+全瘫脊髓提取液+不同浓度TDZD-8。培养2d后观察并比较各组新生大鼠DRG神经元轴突平均长度和微管(Tubulin βⅢ)荧光表达强度。结果:A组、B组和C组之间平均神经轴突长度及轴突远端Tubulin βⅢ表达强度比较,无统计学意义,D组明显减小,与A、B和C组分别比较,有统计学意义(P<0.01)。0.5～3μM TDZD-8处理组平均轴突长度及Tubulin βⅢ荧光表达强度均明显高于A、B、C组,与D组比较,更为显著,差异均具有统计学意义(P<0.01)。5～25μM TDZD-8处理组平均轴突长度与A、B、C组分别比较,明显缩短且有统计学意义(P<0.01),与D组比较无统计学差异(P>0.05);轴突远端Tubulin βⅢ表达比A、B、C、D组及0.5～3μM TDZD-8处理组明显增强,有统计学意义(P<0.01)。结论:完全瘫痪脊髓提取液明显抑制DRG神经元轴突生长,轴突回缩。低浓度TDZD-8能促进轴突生长,形成多个轴突或轴突分支,而高浓度TDZD-8明显抑制轴突生长,导致轴突回缩。

TDZD-8对乙醛激活肝星状细胞中Wnt通路的作用研究

目的检测乙醛激活肝星状细胞中GSK-3β抑制剂TDZD-8对Wnt信号通路的作用。方法体外培养大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),经乙醛刺激细胞活化后,分空白对照组和阻断组,阻断组加入TDZD-8(终浓度20μm/L)作用12h,MTT法检测细胞增殖;提取蛋白Western blotting检测Wnt途径下游产物β-catenin的表达状况及磷酸化水平变化。结果 MTT检测结果发现TDZD-8阻断GSK-3β之后乙醛刺激的肝星状细胞增殖高于对照组(P<0.05);Western blotting检测结果显示使用TDZD-8激活Wnt途径后,Wnt途径下游产物β-catenin表达无明显变化,但p-β-catenin水平下降。结论在乙醛激活的肝星状细胞中,TDZD-8能有效激活Wnt信号通路从而刺激肝星状细胞转分化为肌成纤维细胞。

糖原合成酶激酶-3β抑制剂TDZD-8抑制大鼠C6胶质细胞瘤细胞体外增殖及诱导凋亡的作用和机制

目的:探讨糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)对大鼠C6胶质细胞瘤细胞增殖的抑制作用及诱导凋亡的机制。方法:采用MTT方法检测TDZD-8不同浓度(10、20、40和80μmol/L)处理大鼠C6胶质细胞瘤细胞6、12、24和48 h后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测其对细胞凋亡和细胞周期的作用,同时分析凋亡相关基因Bax、Bcl-2和P53的表达变化。结果:TDZD-8浓度、时间依赖性的抑制大鼠C6胶质细胞瘤细胞的增殖(P<0.05)。流式细胞术显示TDZD-8浓度依赖诱导细胞凋亡,其中在20、40和80μmol/L组有统计学差异(P<0.05)。40和80μmol/L TDZD-8处理C6细胞后,G0/G1期细胞数量明显增多,分别升高到83%和90%(P<0.05);而S期和G2/M期细胞数则显著降低(P<0.05)。同时,40和80μmol/L TDZD-8使Bax和P53表达显著增加,而使Bcl-2表达降低(P均<0.05)。结论:GSK-3β抑制剂TDZD-8可以浓度依赖性抑制C6细胞增殖同时诱导其凋亡,并引起细胞周期阻滞,这可能与其对Bax、P53和Bcl-2的调控相关。

TDZD-8对大鼠一氧化碳中毒迟发性脑病防治作用的实验研究

目的研究葡萄糖原合酶-3β（glycogensynthasekidnase 3β，GSK-3β）抑制剂4-benzyl-2-methyl-1，2，4-thiadiazolidine-3，5-dione（TDZD-8）对一氧化碳（carbonmonoxide，CO）中毒大鼠迟发性脑病（delayedneuropsychologicalsequelae，DNS）发生率、神经细胞形态学以及Tau蛋白过度磷酸化的影响。方法大鼠经Morris水迷宫训练l周后随机数字表法随机选取10只作为空白对照组（Con组）。余大鼠采用腹腔注射CO气体建立急性CO中毒模型（染毒），将存活大鼠采用随机数字表法分为CO中毒模型组（Mod组）、TDZD-8低剂量组（TL组）、TDZD-8中剂量组（TM组）、TDZD-8高剂量组（TH组），每组10只。各组大鼠均接受6d高压氧治疗。染毒后15d应用Morris水迷宫筛选DNS大鼠。于染毒后21d灌注固定取脑组织，采用苏木精伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色检测脑组织病理学变化，免疫组化检测脑组织Tau蛋白磷酸化。结果Mod组大鼠逃避潜伏期（39．7＋20．5）s较Con组（11．0±3．5）s显著延长（P〈0．05），DNS发生率高达70％，脑组织病理损害明显，皮质及海马P-tau（Serl99）阳性细胞较Con组明显增多（P〈0．05）。TDZD-8各干预组较Mod组逃避潜伏期缩短，DNS发生率下降，脑组织病理损害减轻，皮质及海马P-tau（Serl99）阳性细胞减少，但仅TM组与Mod组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。DNS大鼠较非DNS大鼠皮质及海马P-tau（Serl99）阳性细胞明显增多。结论Tau蛋白过度磷酸化可能参与了CO中毒大鼠DNS的病理过程。TDZD-8对大鼠CO中毒DNS脑损伤具有保护作用。

TDZD-8对小鼠急性胰腺炎的治疗作用

目的:探讨TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)对小鼠急性胰腺炎(AP)的治疗作用。方法:54只BALB/c小鼠随机均分为对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组采用腹腔注射雨蛙素[50μg/(kg·h),共13次]诱导AP,对照组以同样的方式注射同体积的生理盐水,治疗组在末次注射雨蛙素30 min后,腹腔注射10 mg/kg TDZD-8。于末次注射雨蛙素后3,6,12 h,各组分别取动物6只,测定血淀粉酶、白细胞介素6(IL-6)水平,HE染色后观察胰腺组织病理学改变,免疫组化法分析胰腺核因子κB(NF-κB)的表达。结果:与对照组比较,模型组与治疗组血淀粉酶与IL-6水平,胰腺组织病理学评分与NF-κB表达水平明显升高,且均随时间延长而逐渐升高,但治疗组的上述指标在各时间点上均明显低于模型组,所有差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:TDZD-8对小鼠急性胰腺炎有保护作用,其保护机制可能与抑制NF-κB活性,从而减轻炎症反应有关。

GSK-3β在斑马鱼脑缺氧/复氧损伤中的作用及其对微管相关蛋白2的影响

目的探究斑马鱼脑缺氧/复氧(H/R)过程中糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的作用及其对微管相关蛋白2(MAP2)的影响。方法建立斑马鱼H/R模型,选用健康同等体型成鱼,分为对照(Control)组、缺氧/复氧(H/R)组、缺氧/复氧+GSK-3β抑制剂(H/R+TDZD-8)组进行实验。选取各组斑马鱼脑组织,通过qRT-PCR测定缺氧诱导因子Hif-1αa、Hif-1αb在不同复氧时间点mRNA表达情况,TTC染色与TUNEL染色检测脑梗死面积及细胞凋亡,Western blot检测Hif-1α、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser 9)、MAP2的蛋白表达水平,免疫荧光染色检测MAP2在脑中的分布和表达情况。结果与Control组相比,H/R组Hif-1αa、Hif-1αb的mRNA及Hif-1α蛋白表达水平升高(P<0.01),脑梗死面积及凋亡细胞增多(P<0.01),p-GSK-3β(Ser 9)/GSK-3β比值、MAP2蛋白表达降低(P<0.05),MAP2免疫荧光表达下降(P<0.01);与H/R组比较,TDZD-8预处理能够减少斑马鱼脑梗死面积及细胞凋亡(P<0.01),增加p-GSK-3β(Ser 9)/GSK-3β比值、MAP2蛋白表达(P<0.01),增加MAP2免疫荧光表达(P<0.01)。结论缺氧/复氧可造成斑马鱼脑神经元损伤,其机制可能与抑制GSK-3β磷酸化和MAP2的表达有关。GSK-3β特异性抑制剂TDZD-8可通过促进p-GSK-3β(Ser 9)的表达,减少MAP2的降解,从而逆转缺氧/复氧对斑马鱼脑神经元的损伤。

糖原合成酶激酶-3β抑制剂对肝热缺血再灌注损伤的保护

目的:研究糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂TDZD-8对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤的保护作用。方法:将大鼠随机分为4组:A组(假手术+空白对照)、B组(假手术+TDZD-8)、C组(I/R+空白对照)和D组(I/R+TDZD-8,实验组)。通过肝门阻断30min建立大鼠缺血再灌注模型,分别于再灌注后2、12h,每组各选取8只大鼠,测定血清ALT、AST含量,行肝组织形态学检测;TUNEL检测肝细胞凋亡,计算凋亡指数(AI);采用实时定量PCR方法检测肝Bcl-2mRNA转录水平。结果:预先给予TDZD-8组在缺血再灌注期各时相点肝组织结构受损相应较轻,血清ALT、AST含量及凋亡指数均较低(P<0.05);Bcl-2mRNA则显著上升。结论:GSK-3β抑制剂可显著减轻肝脏缺血再灌注损伤程度,上调肝脏Bcl-2mRNA转录,抑制肝细胞凋亡。

三甲氧基没食子酸1,2,4-噻二唑-3,5-二酮衍生物的合成及其对HL60细胞增殖的抑制作用

合成了三甲氧基没食子酸1,2,4-噻二唑-3,5-二酮系列衍生物4a^4e,采用MTT法测定了中间产物2、3和目标化合物4a^4e对急性白血病HL60细胞增殖的抑制作用,并考察了4b和4c与阳性对照TDZD-8对HL60细胞增殖抑制的协同作用。结果表明:化合物2~4对HL60细胞增殖均有一定的抑制作用,其中化合物4b和4c抑制效果较好,半数抑制浓度(IC50)分别为10.60和6.31μmol/L;而TDZD-8对HL60细胞的IC50值为0.30μmol/L。此外,4b和4c协同TDZD-8对急性白血病细胞株HL60具有较好的增殖抑制作用,当4b和TDZD-8浓度分别为5.0和0.34μmol/L时,两者的协同抑制率为94.45%,协同指数CI值为0.58;当5c和TDZD-8浓度分别为5.0和0.34μmol/L时,两者的协同抑制率为98.76%,协同指数(CI)值为0.31。可以看出,新型没食子酸1,2,4-噻二唑-3,5-二酮衍生物具有作为治疗人急性白血病药物先导物的潜力。

GSK3β/eEF2K信号通路对小鼠肺纤维化过程的影响

目的:探讨糖原合成酶激酶-3(GSK3β)/真核延伸因子激酶2(eEF2K)信号通路对肺纤维化进程的影响,为临床治疗肺纤维化寻找新的思路。方法:采用一次性气管注射法构建C57BL/6雄性小鼠博莱霉素肺纤维化模型,造模14 d后将动物分成模型组、阴性抑制组与抑制组(n=5),另设空白组不作处理。抑制组使用腹腔注射TDZD-8(4 mg/kg),阴性抑制组腹腔注射二甲基亚砜(DMSO)溶液,28 d后处死采集指标。采用苏木精-伊红染色法检测小鼠肺脏病变情况;试剂盒水解法检测肺组织中羟脯氨酸(Hyp)的含量;采用Western blot法检测肺脏中GSK3β、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)、eEF2K、p-eEF2K(Ser70)、p-eEF2K(Ser392)、p-eEF2K(Ser470)、基质金属蛋白酶-2前体蛋白(pro-MMP-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达水平,使用免疫组织化学法检测肺脏中MMP-2、胶原蛋白I(Col I)、胶原蛋白Ⅲ(ColⅢ)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)的表达。结果:与空白组相比,模型组中GSK3β、p-GSK3β、p-eEF2K(Ser70)、p-eEF2K(Ser392)、p-eEF2K(Ser470)、pro-MMP-2、MMP-2、Col I、ColⅢ、α-SMA蛋白表达水平升高,eEF2K蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组相比,抑制组GSK3β、p-GSK3β、p-eEF2K(Ser70)、p-eEF2K(Ser392)、p-eEF2K(Ser470)、pro-MMP-2、MMP-2、Col I、ColⅢ、α-SMA蛋白表达降低,eEF2K蛋白表达升高(P<0.05)。结论:GSK3β能通过Ser70、Ser392、Ser470这3个位点磷酸化激活eEF2K,增加纤维化指标含量,促进肺纤维化形成,加重肺组织病变。

GSK-3β抑制剂对急性坏死性胰腺炎肾损伤作用机制的实验研究

目的探讨糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂TDZD-8对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠相关肾损伤保护作用的机制.方法SPF级雄性Wistar大鼠,按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、ANP模型组、TDZD-8干预组和TDZD-8对照组,每组20只.采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备大鼠ANP模型;Sham组胰胆管内注入等量生理盐水.TDZD-8干预组和TDZD-8对照组于制模或假手术前30 min经股静脉注射GSK-3β抑制剂TDZD-8(1 mL/kg);ANP模型组和Sham组则注射等量10%二甲基亚砜(DMSO).术后12 h取大鼠下腔静脉血、胰腺和肾脏组织,测定血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIPA)、血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)水平,并观察胰腺、肾脏组织病理学改变和肾脏超微结构改变,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL-1β、IL-6)含量,免疫组化法检测核转录因子-κB p65(NF-κB p65)在肾脏中的定位表达,蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肾脏组织GSK-3β、磷酸化GSK-3β〔p-GSK-3β(Ser 9)〕、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和IL-10的蛋白表达.结果与Sham组比较,ANP模型组血清学指标、炎性因子水平明显升高,胰腺和肾脏组织病理损伤严重,组织病理学评分明显升高,肾脏组织细胞核内NF-κB p65表达增强,GSK-3β、TNF-α、ICAM-1、iNOS蛋白表达明显增强,p-GSK-3β(Ser 9)、IL-10蛋白表达明显减弱.与ANP模型组比较,TDZD-8预处理可显著降低ANP大鼠血清学指标和炎性因子水平〔AMY(kU/L):5.60±0.30比10.07±0.34,LIPA(U/L):1 111.0±110.8比2 375.0±51.1,SCr(μmol/L):47.38±1.48比72.50±2.43,BUN(mmol/L):17.6±1.0比26.0±1.0,IL-1β(ng/L):195.90±5.50比332.40±38.29,IL-6(ng/L):246.10±26.74比385.30±32.19,均P<0.01〕,减轻胰腺和肾脏组织病理损伤〔组织病理评分(分):7.1±0.4比12.1±0.3,301.2±7.5比433.5±13.8,均P<0.01〕及肾脏细胞超微结构损伤,细胞核内NF-κB p65表达明显减少,肾脏组织中p-GSK-3β(Ser 9)表达明显增加,且阻断GSK-3β活性能够抑制TNF-α、ICAM-1、iNOS的表达,提高IL-10的表达,而GSK-3β表达差异无统计学意义.TDZD-8对照组各项指标与Sham组比较差异均无统计学意义.结论GSK-3β抑制剂TDZD-8可有效导致ANP大鼠肾脏GSK-3β磷酸化而使其活性受到抑制,从而抑制肾脏NF-κB炎症通路激活及中性粒细胞的募集,进一步抑制其下游炎性介质的释放,减轻肾脏炎症及病理损伤.

不同类型GSK-3β抑制剂对重症急性胰腺炎大鼠肾损伤的作用及量效关系

目的 观察TDZD-8 干预大鼠重症急性胰腺炎（SAP）肾损伤的量效关系，并将三种常用GSK-3β 抑制剂TDZD-8、氯化锂（LiCL）、SB216763 对该模型的作用效果进行对比，以探讨针对SAP 并发肾损伤大鼠模型最有效的GSK-3β 抑制剂类别及其有效、安全的最佳剂量。方法 96 只SPF 级雄性Wistar 大鼠，随机（随机数字法）分为8 组（n=12） ：假手术组（SO 组）、重症急性胰腺炎组（SAP 组）、TDZD-8 预处理组0.25、0.5、1.0、2.0 mg/kg（TD 组，分别标记为TD1、TD2、TD3、TD4 组），LiCL 预处理组 （L 组） 和SB216763 预处理组（SB 组），胰胆管逆行注射5% 牛磺胆酸钠制作SAP模型。术后12 h 剖杀各组大鼠，测定各组大鼠腹水量、血清AMY、Cr、BUN 和ALT 水平，并观察胰腺、肾脏组织病理学变化。结果 SAP 组腹水量、AMY、Cr、BUN、ALT 水平以及胰腺、肾脏病理评分均较SO 组显著升高（P〈0.05） ；TD1 组几乎对SAP 无缓解作用，TD2、TD3、TD4、L 组和SB 组均能不同程度地减少SAP 大鼠的腹水量，降低血清AMY、Cr、BUN 水平，并显著降低胰腺组织病理评分，差异有统计学意义（P〈0.05） ；TD2、TD3 均能不同程度地减少ALT 水平（P〈0.05），而TD4 组ALT 水平较高，与SAP 组相似；TD2 对各个指标的效果不如TD3 组作用显著，两者比较各项指标差异均有统计学意义（P〈0.05）。 对SAP 大鼠腹水量和ALT 水平的改善作用，TD 组中最佳剂量组TD3组与L 组和SB 组比较，差异无统计学意义（P〉0.05） ；而TD3 组的AMY、Cr、BUN 水平以及胰腺、肾脏病理评分均较L 组和SB 组降低更显著，差异有统计学意义（P〈0.05） ；L 组Cr、BUN 水平和胰腺、肾脏病理学评分与SB 组比较均降低更显著，差异有统计学意义（P〈0.05） ；Western blot 检测发现各组中GSK-3β 蛋白表达均处于较一致的水平，差异无统计学意义（P〉0.05） ；而p-GSK-3β ser9在 SAP 组表达低于SO 组，差异有统计学意义（P〈0.05） ；TD3、L、SB 三组中的p-GSK-3β ser9 均较SAP 组明显增强，其中以TD3 组表达最强，同时 L 组表达强于SB 组，组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 通过对TDZD-8、LiCL 和SB216763 对大鼠SAP 肾损伤模型的作用比较可知TDZD-8 是针对该模型最有效的GSK-3β 抑制剂。对于牛磺胆酸钠诱导的SAP 并发肾损伤大鼠模型，静脉给予TDZD-8 1 mg/kg 预处理对该模型是安全有效的最佳剂量。