TIM-1-Fc融合蛋白对哮喘小鼠Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡的调节

目的制备T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域1(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-1,TIM-1)-Fc融合蛋白并探讨TIM-1-Fc融合蛋白对卵白蛋白(ovabumin,OVA)诱导的哮喘小鼠的干预作用及潜在作用机制。方法通过基因工程技术获得TIM-1-Fc融合蛋白。采用腹腔注射OVA氢氧化铝溶液致敏建立过敏性哮喘小鼠模型,随机分为对照组、哮喘组和TIM-1-Fc干预组。每次干预前20 min,使用40μL卵白蛋白生理盐水溶液(OVA-NS)滴鼻,TIM-1-Fc融合蛋白干预包括TIM-1-Fc滴鼻组(每只小鼠每次给予1μg/40μL TIM-1-Fc滴鼻)和TIM-1-Fc注射组(每只小鼠每次给予6μg/200μL TIM-1-Fc腹腔注射),每天1次,连续7 d,对照组用生理盐水替代。采用苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理变化;采用流式细胞术检测小鼠外周血中辅助性T细胞2(type 2 T helper cells,Th2)、辅助性T细胞17(type 17 T helper cells,Th17)和调节性T细胞(Treg)比例及相关细胞因子水平。结果成功构建TIM-1-Fc融合蛋白,成功构建OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型。与哮喘组相比,TIM-1-Fc融合蛋白干预后显著减轻了哮喘小鼠气道炎性损伤和肺组织损伤;TIM-1-Fc融合蛋白干预能显著降低外周血中TIM-1^(+)CD4^(+)T细胞和TIM-1^(+)Th17细胞比例,使TIM-1^(+)Treg细胞增多,显著降低Th2、Th17细胞比例,提高Treg细胞比例,调节哮喘中Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡。结论TIM-1-Fc融合蛋白改善OVA诱导的过敏性哮喘小鼠气道炎症和肺组织损伤,其作用机制可能与TIM-1-Fc融合蛋白对Th1/Th2和Th17/Treg的免疫调节有关。

T细胞免疫球蛋白黏蛋白3/半乳糖凝集素9(TIM-3/galectin-9)在肿瘤免疫中的研究进展

随着对免疫检查点研究的不断发展,通过阻断免疫检查点对肿瘤进行靶向治疗已成为肿瘤治疗的重要手段之一。T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)作为负性免疫检查点,与其配体半乳糖凝集素9(Gal-9)的结合已在多种癌症中被证明可促进肿瘤免疫逃逸。在血液、消化、呼吸系统肿瘤中,通过阻断TIM-3/Gal-9影响不同信号通路,调节机体T细胞、B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、单核/巨噬细胞生长,抑制调节性T细胞发挥抗肿瘤作用。TIM-3抗体作为免疫检查点抑制剂在分子靶向抗肿瘤中具有潜在的治疗价值。文中总结了靶向TIM-3/Gal-9在多种癌症的肿瘤微环境中抗肿瘤的作用机制。

TIM1与TIM4对小鼠食物过敏模型中CD4^+CD25^+调节性T细胞功能的影响

目的:探讨在食物过敏小鼠模型中CD4+CD25+Treg细胞的功能状态及TIM4与TIM1对其的影响,分析食物过敏的发生机制.方法:无受试蛋白喂养BALB/c小鼠32只,随机分为4组:空白对照组、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)+卵清蛋白(OVA)共同作用组、TIM1抗体干预组及TIM4抗体干预组,分别于0、3、9dip生理盐水,SEB和OVA,TIM1抗体+SEB+OVA,TIM4抗体+SEB+OVA,并于第7、14天给予SEB+OVA(空白对照组以生理盐水ig)ig.RT-PCR检测空肠及脾脏Foxp3mRNA表达、空肠TIM4mRNA表达,ELISA法测定血清TGF-β1与IL-10的表达.免疫组织化学法检测空肠黏膜TGF-β1与IL-10表达.结果:与空白对照组相比,SEB+OVA共同作用组小鼠空肠及脾脏Foxp3mRNA表达明显下降(0.401±0.145vs0.732±0.162;0.407±0.082vs0.691±0.145,均P<0.05),TIM4mRNA表达明显增高(P<0.05),血清和空肠黏膜TGF-β1表达显著降低(7859.853±126.704ng/Lvs8342.814±488.461ng/L;108.834±9.634ng/Lvs156.298±12.002ng/L,均P<0.05);与SEB+OVA组相比,TIM1和TIM4抗体干预组小鼠空肠及脾脏Foxp3mRNA及血清和空肠黏膜TGF-β1表达显著增高(均P<0.05).结论:TIM4与TIM1抗体干预可恢复SEB+OVA致敏小鼠Treg细胞功能,维持耐受平衡,减轻过敏症状,提示TIM4-TIM1通路可能在食物过敏的发生中起重要作用.

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆小鼠TIM-3基因,构建原核表达载体,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法:以小鼠脾细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3基因编码区,构建pRSET-B-TIM-3原核表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;然后常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,用Western blot、免疫组化、流式细胞术检测抗体的特异性。结果:成功构建的原核表达载体pRSET-B-TIM-3在大肠杆菌中诱导后可以高效表达TIM-3蛋白;免疫获得的多克隆抗体经过ELISA检测,抗体效价为1∶320 000,经Western blot、免疫组化和流式细胞术等鉴定,抗体的特异性较好。结论:成功克隆出小鼠的TIM-3基因,构建了原核表达载体,制备的兔抗小鼠TIM-3多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。

TIM4对小鼠食物过敏模型中抗原特异性Th2细胞分化的影响

目的:研究微生物产物对树突状细胞(dendriticcell,DC)和TIM4的作用,探讨在微生物产物参与的食物过敏(foodallergy,FA)中TIM4对CD4+T淋巴细胞分化的影响.方法:培养Balb/c小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrow-derived DC,BMDC),培养的DC分为两组:金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激组和空白对照组,RT-PCR检测不同组DC的TIM4 mRNA表达;流式细胞仪检测DC表面CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表达.在DC和CD4+T淋巴细胞共同培养中将培养的DC分为5组:空白对照组、SEB+卵清蛋白(OVA)组、SEB组、OVA组及TIM4组,同时取过敏模型小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,不同组的DC与CD4+T淋巴细胞共同培养,ELISA法测定混合培养细胞上清液IL-4与IFN-γ的表达.结果:与空白对照组相比,SEB组DCTIM4 mRNA表达明显增高(0.941±0.018vs0.422±0.083,P<0.05),并具有剂量依从性.SEB组DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表达明显高于空白对照组(MHC-Ⅱ:76.684%±3.1803%vs52.984%±3.6026%;CD86:89.746%±2.113%vs67.558%±0.4341%,均P=0.000).DC和CD4+T淋巴细胞共同培养中,相比空白对照组,SEB+OVA组IL-4表达显著增高(295.834±20.408vs78.335±13.109,P<0.05),而IFN-γ的表达明显减少(362.109±92.271vs761.897±102.967,P<0.05);单独的SEB组或OVA组IL-4和IFN-γ与空白对照组无明显差异;TIM4组中IL-4的表达水平较SEB+OVA组明显降低,而IFN-γ的表达明显增高(90.511±15.500vs295.834±20.408;807.734±95.436vs362.109±92.271,均P<0.05).结论:微生物产物和食物抗原共同作用导致FA,TIM4参与FA的发生.消除TIM4的表达可明显抑制Th2细胞分化,有效纠正Th1/Th2细胞失衡,可阻止过敏性免疫反应.

外周血单个核细胞Tim-3及其配体HMGB1在HBV相关肝癌诊断中的意义

目的:检测Tim-3-HMGB1在HBV相关肝癌患者中的表达水平.方法:收集35例肝癌患者及40例健康对照外周血,采用Ficoll-Hypaque梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),分别提取血清病毒DNA及总RNA,普通聚合酶链反应(PCR)检测HBV-DNA、Tim3表达水平;实时荧光定量PCR检测HMGB1表达水平.结果:HBV相关肝癌患者外周血单个核细胞Tim-3(P<0.01)-HMGB1(P=0.019)表达水平均增高.结论:HBV相关肝癌患者外周血单个核细胞Tim-3-HMGB1表达水平增高,可作为辅助诊断指标应用.

T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子1(Tim-1)促进马尔堡病毒感染的作用研究

目的体外评价Tim-1对马尔堡假病毒感染细胞的促进作用。方法通过转染MARV-GP质粒制备马尔堡假病毒,并通过瞬转Tim-1表达质粒制备高表达Tim-1的HEK-293T细胞作为靶细胞,采用生物发光法评价Tim-1及其多态性对MARV感染的促进作用,最后检测Tim-1-ECD重组蛋白对Tim-1促进作用的阻断效果。结果成功制备了马尔堡假病毒且对HEK-293T细胞有较高的感染性,Tim-1能丰度依赖性地增强马尔堡假病毒的感染。Tim-1-359aa和-364aa均有促进作用,Tim-1-359aa的增强效应强于Tim-1-364aa。Tim-1-ECD重组蛋白可显著抑制Tim-1对马尔堡假病毒感染的促进作用。结论Tim-1能够显著增强马尔堡假病毒的感染性。

斜带石斑鱼T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(TIM-4)基因表达及重组蛋白制备

为研究斜带石斑鱼Epinephelus coioides T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 4,TIM-4)在免疫应答过程中的作用,通过聚合酶链式反应(PCR)获得斜带石斑鱼TIM-4的蛋白编码区(GenBank登录号:MZ465580),利用生物信息学分析其结构特征,采用荧光定量PCR(qPCR)分析TIM-4在健康鱼体中的组织分布,以及经LPS和Poly I:C刺激后的表达变化,并构建原核表达载体质粒TIM-4-4T,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行TIM-4重组蛋白诱导表达。结果表明:斜带石斑鱼TIM-4基因的蛋白编码区片段长度为702 bp,可编码234个氨基酸,含有V-Type(IGV)、BTK和PRY 3个功能结构域;qPCR显示,TIM-4基因在斜带石斑鱼10种组织中均有表达,在胃中的表达量最高(P<0.05),在脾脏中表达量最低;经LPS刺激后,脾脏细胞中的TIM-4表达量显著降低(P<0.05),而经Poly I:C刺激后,脾脏细胞中的TIM-4表达量显著升高(P<0.05);SDS-PAGE电泳显示,TIM-4重组蛋白相对分子质量约为25100,以包涵体形式表达,在0.4 mmol/L IPTG、37℃下诱导6 h时,TIM-4重组蛋白的表达量最大。研究表明,TIM-4基因可能参与了斜带石斑鱼抗感染免疫反应,本研究结果为深入了解TIM-4的生物学功能提供了理论基础。

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3精细化调控免疫应答的机制

机体免疫应答的动态变化及空间差异是疾病精细化治疗的理论基础之一,同一免疫调节分子在不同时空条件下的功能可能截然不同。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin-containing protein-3,TIM-3)是新近鉴定出的免疫检查点分子,与CTLA-4、PD-1等一样参与了免疫细胞稳态调控,TIM-3的异常高表达与肿瘤、慢性病毒感染的相关性使其成为免疫靶向治疗的关注点。靶向免疫检查点分子的临床治疗给患者带来了希望,但也存在效率不高、耐药乃至副作用明显等情况,问题的解决有赖于该类分子精细调控机制的阐明。大多数数据显示TIM-3具免疫抑制作用,但也有相反的报道。TIM-3的配体多样,胞内信号转导机制仍不十分明确。此外,血清中存在的可溶性TIM-3蛋白的功能及临床意义目前尚不清楚。如果免疫系统进化的过程中也赋予了TIM-3多重的免疫调节功能,阐明其调控机制必将对后续的应用研究提供重要参考。

基于结构的单绕蛋白聚类图构建与分析

蛋白质分子进化规律研究是分子进化研究的重点,对揭示生命起源与进化机制有重要意义。本文对已知空间结构及物种信息的单绕蛋白,利用结构比对信息,构建了不同层次单绕样本系统聚类图。分析发现:功能相似蛋白存在明显聚集现象,同一超家族样本基本聚在一个大支中,同一家族样本集中在所属超家族下的小支中,功能约束下单绕样本聚类图与物种进化图有较好对应关系。结果表明:单绕蛋白的结构演化反映了蛋白质功能的约束,特定功能单绕样本的结构差异具有种属特异性,结构演化包含了物种进化信息。

蛋白质跨线粒体膜运送的研究进展

线粒体拥有约1000种蛋白质,其中98%以上系由细胞核编码,在细胞质核糖体上以前体形式合成,之后再运至线粒体,经跨膜运送并分选定位于各部分。现对定位于外膜、基质和内膜的蛋白质的运送途径的研究进展作一扼要介绍。脱血红素细胞色素c是细胞色素c的前体,它不含导肽,对其转运的研究概况也作了评述。

可溶性Tim-3体外增强免疫应答的作用及机制研究

目的评价重组人(hTim-3)-Fc融合蛋白在调节免疫应答中的作用及其机制研究。方法分别将重组hTim-3-Fc融合蛋白与人巨噬细胞系U937细胞、T淋巴细胞系Jurkat细胞及正常人外周血细胞共培养,采用ELISA、实时荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western印迹)方法检测免疫相关细胞因子水平的变化,探讨重组hTim-3-Fc融合蛋白对免疫细胞活性的影响并阐明机制。结果重组hTim-3-Fc融合蛋白可显著提高免疫细胞活性,表现为U937中IL-8分泌水平,Jurkat细胞IL-2分泌水平,以及人外周血中IL-2和IFN-γ分泌水平显著升高;在mRNA水平,发现重组hTim-3-Fc融合蛋白能显著提高上述细胞中Ⅰ型干扰素(包括IFN-α2、IFN-β1)的表达。在分子机制方面,重组hTim-3-Fc融合蛋白可增强T细胞(Jurkat)及巨噬细胞(U937)中stat-1的磷酸化水平。结论制备的重组人Tim-3-Fc融合蛋白在体外能显著增强免疫细胞活性,有望成为免疫抑制性疾病新的免疫干预药物。

Tim-3和Galectin-9介导在脓毒症中的免疫调节及其机制研究

目的:分析探究蛋白印记T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)和半乳糖凝集素-9(Galectin-9)介导在脓毒症中的免疫调节及其机制研究。方法:选取我院2017-04-2018-06期间收治的确诊为脓毒症的患者30例,另选在我院接受健康体检者30例,分别作为研究组和对照组,借助不同组研究者体内的RNA,逆转录后通过PCR扩增检测患者体内的蛋白印记Tim-3和Galectin-9表达程度。结果:研究组患者的蛋白印记Tim-3和Galectin-9表达程度明显高于对照组(P<0.05),研究组患者体内T淋巴细胞等免疫细胞含量明显小于对照组(P<0.05),研究组患者体内的吞噬细胞明显高于对照组(P<0.05);研究组患者CD_4^+、CD_8^+并计算CD_4^+/CD_8^+显著高于对照组(P<0.05)。结论:脓毒症的发生常常伴随蛋白印记Tim-3和Galectin-9表达程度的异常升高,患者的免疫力较差,体内免疫细胞含量的异常以及吞噬细胞等被异常激活,具较严谨的信号通路,在临床诊断中可参考体内的免疫细胞数量进行确诊,具较高的参考价值。

Tim-3与肿瘤免疫的研究进展

肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，其治疗一直是医学领域的难点。近些年来，以抗体为代表的免疫治疗策略在肿瘤治疗的相关研究中显示出了极大的优势。Tim-3是Tim家族的重要成员，主要表达于辅助性T细胞（Th1）等多种免疫细胞中，其通过与配体的相互作用，可以调节靶细胞的功能状态，在抗感染免疫、自身免疫中均发挥着重要的免疫调控作用，而它在抗肿瘤免疫中的功能也逐渐受到重视。针对Tim-3的靶向干预有望成为肿瘤的免疫治疗中的新策略。

晚期血吸虫病患者外周血CD4^+T细胞Tim-3分子表达及与肝功能损伤指标的相关性

目的检测T细胞免疫球蛋白域黏蛋白结构域分子3(T cell immunoglobulin and mucin domain protein 3,Tim-3)在晚期血吸虫病患者外周血CD4+T细胞表面的表达,并探讨其与肝功能损伤指标的关系。方法以28例晚期血吸虫病患者作为研究对象,同时选择20例慢性血吸虫病患者和30例健康人群作为对照,采用流式细胞术检测CD4+T细胞Tim-3表达水平,用ELISA法检测血清干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)水平,以日立7600型生化分析仪检测肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)和总胆红素(TBIL)浓度。结果晚期血吸虫病、慢性血吸虫病患者以及健康人群外周血CD4+T细胞表面Tim-3表达水平差异具有统计学意义(F=4.578,P<0.05),晚期血吸虫病患者外周血CD4+T细胞Tim-3表达水平为(8.33±2.28)%,显著高于健康对照人群的(6.57±1.99)%(t=3.015,P<0.01)。Spearman相关分析显示,晚期血吸虫病患者外周血CD4+T细胞Tim-3表达水平与患者血清ALT(rs=0.746,P<0.01)、γ-GT(rs=0.656,P<0.01)、IL-4水平(rs=0.672,P<0.01)呈正相关,与IFN-γ水平(rs=-0.404,P<0.05)呈负相关。结论晚期血吸虫病患者外周血CD4+T细胞Tim-3表达上调,其可能通过调节CD4+T细胞功能参与晚期血吸虫病肝损伤过程。

TIM-4基因多态性与湖北地区汉族人群支气管哮喘易感性的研究

目的探讨T细胞免疫球蛋白域及黏蛋白域蛋白4（Tcells immunoglobulin domain and mucin domain protein-4，TIM-4）基因外显子2区Lys65Lys（G／A）、外显子9区Val365Met（G／A）的单核苷酸多态性（SNP）与湖北地区汉族人群支气管哮喘易感性的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法对湖北地区185例哮喘患者和162例健康者TIM-4基因外显子2区Lys65Lys（G／A）、外显子9区Val365Met（G／A）的多态性进行分析，计算基因型和等位基因频率。结果（1）湖北地区汉族人群健康者TIM-4基因外显子2区Lys65Lys（G／A）位G／G、G／A、A／A基因型频率分别为0．840、0．160、0，而哮喘人群其频率分别为0．859、0．141、0，其基因型和等位基因型频率与对照组相比差异均无统计学意义（P=0．603，P=0．618）；（2）本试验未检测到TIM-4外显子9区Val365Met（G／A）的多态性。结论湖北地区汉族人群TIM4基因外显子2区Lys65Lys（G／A）存在单核苷酸多态性变异，但该位点的变异与湖北地区汉族人群支气管哮喘易感性无关；TIM-4基因外显子9区VaD65Met（G／A）在湖北地区汉族人群中未发现单核苷酸多态性。

溃疡性结肠炎患者外周血Tim-4 mRNA表达水平的变化及意义

目的探究溃疡性结肠炎患者外周血Tim-4 mRNA的表达变化及临床意义。方法选取2015年2月~2019年4月我院收治的溃疡性结肠炎患者38例作为观察组,另选取同期来我院体检的健康者30名作为对照组,采用荧光定量PCR测定外周血Tim-4 mRNA表达水平,比较两组Tim-4 mRNA、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)表达水平及观察组Tim-4 mRNA与CRP和ESR的相关性。结果观察组Tim-4 mRNA、CRP、ESR表达均高于对照组[(0.79±0.37)vs(0.33±0.20)]、[(6.08±3.21)mg/L vs(0.99±0.87)mg/L]、[(19.12±12.13)mm/h vs(5.58±4.10)mm/h],差异有统计学意义(P<0.05)。观察组外周血单个核细胞Tim-4 mRNA表达水平与CRP呈正相关(r=0.376,P<0.05),而与ESR无相关性(r=0.077,P>0.05)。结论溃疡性结肠炎患者Tim-4 mRNA异常上调,并与CRP密切相关,可能参与溃疡性结肠炎的致病过程。

重组人可溶性TIM-3稳转细胞株的构建及其分泌蛋白的表达

该研究通过慢病毒感染的方式构建携带T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3及可结晶区域[T cell immunoglobulin and mucin domain 3 and fragment of crystallizable,TIM-3(Fc)]目的基因的稳定转染细胞株并检测TIM-3(Fc)分泌蛋白的表达。设计特异性引物PCR扩增TIM-3(Fc)片段,重组插入慢病毒表达载体pCD513中并鉴定阳性克隆,无内毒素提取质粒pCD513-TIM-3(Fc)、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,再利用慢病毒感染悬浮HEK293细胞,最后通过嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株293/TIM-3。再通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测TIM-3(Fc)目的基因在转录和翻译水平上的表达,用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)检测细胞产生TIM-3(Fc)分泌蛋白的能力。成功构建了pCD513-TIM-3(Fc)慢病毒表达载体,qRT-PCR、WB和TRFIA检测表明,293/TIM-3细胞株成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白。成功构建了重组人可溶性TIM-3稳定转染细胞株293/TIM-3并成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白,为进一步研究可溶性TIM-3蛋白的生物学功能提供基础。