党参炔苷调节TIM3/Gal9信号通路对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的研究党参炔苷调节T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子3(TIM3)/半乳糖凝集素9(Gal9)信号通路对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响。方法以CCK-8法检测0、15、30、60、90、120、150mg/L的党参炔苷处理后的子宫内膜癌细胞HEC-1-A存活率,筛选出其最佳作用浓度。将体外培养的HEC-1-A细胞随机分为对照组、党参炔苷组、TIM3敲低组、空载组、党参炔苷+TIM3过表达组,分组处理后以实时荧光定量PCR和免疫印迹检测各组细胞TIM3/Gal9通路表达;以免疫荧光染色和CCK-8法检测各组细胞增殖;以流式细胞术检测各组细胞凋亡;以免疫荧光染色检测各组细胞凋亡相关蛋白表达,比较Bax/Bcl-2。将人外周血淋巴细胞与各组细胞以不同比例共培养后以CCK-8法检测其对各组细胞的杀伤率。结果与对照组比较,党参炔苷组、TIM3敲低组细胞TIM3、Gal9 mRNA及蛋白表达、Ki67阳性率、存活率降低(P<0.05),凋亡率、Bax/Bcl-2、杀伤率升高(P<0.05);空载组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。与党参炔苷组比较,党参炔苷+TIM3过表达组细胞TIM3、Gal9 mRNA及蛋白表达、Ki67阳性率、存活率升高(P<0.05),凋亡率、Bax/Bcl-2、杀伤率降低(P<0.05)。结论党参炔苷可通过下调TIM3/Gal9信号通路表达来抑制子宫内膜癌细胞增殖并促进其凋亡,还可减弱其免疫逃逸,进而增强免疫细胞对其的杀伤力。

棘球蚴病患者血清中可溶性Tim3/Galectin9的变化

目的研究棘球蚴病患者血清中可溶性Tim3(sTim3)和Galectin9及Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子水平变化在棘球蚴病感染过程中的相关作用。方法通过酶联免疫吸附试验ELISA法检测sTim3/Galectin9的表达水平;采用CBA法检测棘球蚴病患者血清中Th1/Th2细胞因子的分泌水平。结果棘球蚴病患者血清中sTim3的水平升高[(310.927±80.750)pg/ml,P=0.001],Galectin9水平升高[(1.690±1.118)ng/ml,P=0.009],且sTim3和Galectin9表达呈正相关(r=0.29,P=0.04),Th2相关细胞因子IL-4的水平升高(P=0.000),而Th1相关细胞因子IFN-γ水平下降(P=0.000),sTim3与IFN-γ呈负相关关系(r=-0.46,P=0.001)。结论在棘球蚴病感染过程中sTim3和Galectin9水平明显增高,可能有助于棘球蚴发生发展,并在其感染过程中起一定作用。

ITP患者血清中可溶性Tim3/Galectin9水平及其临床意义

目的探讨原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)患者血清中可溶性Tim3(sTim3)、Galectin9及Th1(IFN-γ)、Th2(IL-4)、Th17(IL-17)、Treg(TGF-β)细胞因子表达水平变化在ITP患者发病中的作用及意义。方法采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测35例ITP初诊患者和20例正常对照血清中sTim3、Galectin9及IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β的表达水平。结果与正常对照组比较,35例ITP患者血清中sTim3、Galectin9的表达水平升高(P<0.001);血小板数量降低(P<0.001);Th1和Th17相关细胞因子表达水平升高(均P<0.05),Th2和Treg相关细胞因子表达水平降低(均P<0.05);sTim3与IFN-γ、PLT呈相关性,sTim3与IL-4、IL-17、TGF-β无相关性;Galectin9与sTim3、IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-β、PLT无相关性。结论在ITP患者血清中sTim3和Galectin9表达水平升高,可能在ITP免疫失衡中发挥了一定作用。

TIM3在肿瘤微环境中作用的研究进展

恶性肿瘤严重影响人类健康,目前肿瘤的治疗手段包括放疗、化疗及分子靶向性治疗。细胞免疫系统对肿瘤细胞的杀伤过程包括：肿瘤细胞的识别、肿瘤抗原被呈递给T细胞、T细胞激活及特异性杀伤肿瘤细胞。

小鼠TIM1,TIM2和TIM3基因的克隆与序列分析

目的:克隆小鼠TIM1、TIM2及TIM3基因全长编码区cDNA,同时对其进行序列分析。方法:采用RT-PCR方法,从小鼠活化淋巴细胞中获取TIM1、TIM2及TIM3基因cDNA全长,克隆至pMD18-T载体,选择阳性克隆进行序列测定。结果:扩增得到小鼠TIM1、TIM2及TIM3基因编码区cDNA全长分别是918bp、918bp和846bp,分别编码306、306和282个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论:获得小鼠TIM1、TIM2及TIM3基因的全长克隆,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

抗PD-1免疫治疗获得性耐药机制--新的免疫检查点TIM3激活

近日一篇发表在《Nature Communication》杂志上阐述抗PD-1免疫治疗获得性耐药机制的文章受到读者广泛关注。该文首次报道,抗PD-1免疫治疗发生耐药的主要机制是选择性激活新的免疫检查点TIM3（T cell immunoglobulin domainand mucindomain 3）从而导致免疫逃逸。该研究的发现也受到了许多肿瘤免疫治疗领域专家们的重视,Romero教授对该文进行了点评,并发表在《NatRev Clin Oncol》上。

Tim3对poly(I∶C)介导的小鼠Kupffer细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim3)对poly(I∶C)活化的小鼠肝Kupffer细胞调节作用并探讨其相关机制。方法将真核表达质粒pc DNA3.1-Tim 3转染小鼠肝Kupffer细胞,以Realtime PCR和Western blot法验证Tim 3在小鼠肝Kupffer细胞的表达。通过ELISA法检测质粒pc DNA3.1-Tim 3,并使用Tim 3阻断型抗体和核转录因子kappa B(NF-κB)抑制性配体对poly(I∶C)活化的小鼠肝Kupffer细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)]产生影响,Western blot法检测NF-κB p65、IκBα蛋白表达。结果 Tim 3抑制小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β,Western blot结果显示其降低小鼠肝Kupffer细胞NF-κB p65蛋白和提高IκBα蛋白表达。结论 Tim 3通过NF-κB通路参与了poly(I:C)诱导小鼠肝Kupffer细胞活化的调节。

人外周血TIM3基因敲除T淋巴细胞的制备及其抗肿瘤作用

目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术及质粒电转染技术制备T细胞免疫球蛋白黏液素3(TIM3)基因敲除的人外周血T淋巴细胞,探讨敲除TIM3基因后能否增强T细胞免疫功能及其抗肿瘤作用。方法:通过电转染法将hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒共转染EBV阳性胃癌患者外周血T淋巴细胞,电转24 h后流式细胞术检测转染效率并利用荧光显微镜观察;体外培养过程中观察基因敲除后T细胞增殖活性,流式细胞术验证TIM3基因敲除效率以及细胞表型的变化。用肿瘤抗原肽活化T细胞检测TIM3基因敲除后T细胞分泌细胞因子水平及体外杀伤胃癌AGS-EBV细胞的能力。结果:电转染法能够有效地将hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒敲除体系转入人外周血T淋巴细胞,其转染效率平均达(41.5±3.6)%,基因敲除效率波动在40.0%～50.0%(均P<0.01);经抗原活化后的基因敲除组T细胞的增殖活性和免疫表型未见明显变化,表面活化分子中仅见HLA-DR较对照组明显提高(P<0.05);TIM3基因敲除T细胞分泌TNF-α、IFN-γ的水平显著增高(P<0.01或P<0.05),体外杀伤胃癌AGS-EBV细胞的能力也明显增强(均P<0.05)。结论:用CRISPR-Cas9基因编辑及质粒电转染技术制备人外周血TIM3基因敲除T淋巴细胞的方法简易可行,在体外的扩增活化中保持TIM3基因水平下调并具有更高的免疫应答水平以及更强的抗肿瘤作用。这一新技术的研发为基因工程化细胞免疫治疗提供了新的思路。

Tim3和BAT3在再生障碍性贫血中免疫机制的研究进展

再生障碍性贫血(AA)是一种骨髓造血功能降低的自身免疫性疾病。研究发现异常免疫机制在AA的发病过程中起到调节作用。AA患者体内Th1细胞功能亢进,Th1/Th2细胞比例出现失衡,CD8+T淋巴细胞比例增高,mDC细胞增多,M1/M2型巨噬细胞比例失调,并且NK细胞数量也有一定程度下降。Tim3在AA等疾病中可以通过下游因子Gal9对机体适应性免疫反应进行保护,并在固有免疫系统的各个细胞中也起到调节作用。而BAT3抑制了Tim3在T淋巴细胞中的活性,同时也增强了AA疾病中DC细胞和巨噬细胞的摄取提呈作用,以及NK细胞杀伤抗原的功能。进一步了解Tim3和BAT3两种因子在AA疾病过程中适应性免疫应答和固有免疫应答中的作用机制,有望为AA等相关免疫疾病的治疗开拓新的方法和思路。

Tim3/galectin-9在血液系统肿瘤中的研究进展

血液系统肿瘤发病率呈逐年增高趋势,严重影响人类的健康。除传统放化疗外,免疫治疗已在血液肿瘤的治疗中取得了一定的疗效,但是却受到CD8^(+)T细胞衰竭的限制,而CD8^(+)T细胞衰竭主要与一些免疫检查点抑制剂的激活相关,如T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域3(Tim3)、程序性死亡-1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)等。其中,Tim3受到了越来越多的关注。Tim3与它的配体半乳糖凝集素-9(galectin-9)结合,产生了很强的细胞免疫抑制作用。在许多肿瘤中,Tim3被认为与CD8^(+)T细胞衰竭有关。本文拟对Tim3/galectin-9在血液系统肿瘤中的应用进展作一综述,为临床诊治该类疾病提供理论依据。

Tim3在慢阻肺疾病患者外周血中的表达及其与疾病转归的相关性

目的探讨慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim3)的表达及其与疾病转归的相关性。方法选取2018年1月至2019年6月在干休所就诊的慢阻肺患者63例以及同期健康体检者26例,慢阻肺患者按照临床诊断标准分为轻度组、中度组和重度组。实时荧光定量PCR测定慢阻肺患者治疗前后外周血PBMCs细胞中Tim3的表达,并采用受试者工作特征曲线(ROC)评价Tim3表达水平在慢阻肺患者治疗疗效预测中的价值。结果与健康体检者比较,轻度患者组Tim3表达维持在较低水平,中度和重度患者组其表达明显升高(P<0.05)。治疗后Tim3表达水平也随病情缓解而降低。Tim3预测慢阻肺患者治疗疗效的曲线下面积(AUC)为0.694 (P=0.016),灵敏度为80.0%,特异度为75.0%,截断值(cut off)为0.324ng/mL。结论慢阻肺患者外周血PBMCs细胞高表达Tim3,且随病情严重程度而升高。Tim3可作为判断慢阻肺患者病情好转或恶化的参考指标。

共刺激分子Tim3在急性髓系白血病患者NK细胞及其亚群上的表达分析

目的:分析共刺激分子Tim3在急性髓系白血病(AML)患者NK细胞及其亚群上的表达。方法:回顾性研究2016年8月至2018年8月本院收治的30例急性髓系白血病患者(AML组),另选取同期本院健康体检人员30例作为对照组,统计分析2组人员的外周血CD56dimNK细胞/CD3-CD56^+NK细胞及其上Tim3表达水平、外周血CD56brightNK细胞/CD3-CD56^+NK细胞及其上Tim3表达水平、AML组患者化疗前后外周血CD3-CD56^+NK细胞/淋巴细胞及其上Tim3表达、CD56dimNK细胞/CD3-CD56^+NK细胞及其上Tim3表达水平、Tim3^+NK及Tim3-NK细胞IFN-γ分泌水平。结果:AML组患者的外周血CD56dimNK细胞/CD3-CD56^+NK细胞及其上Tim3表达水平均显著低于对照组(P<0.05),外周血CD56brightNK细胞/CD3-CD56^+NK细胞及其上Tim3表达水平均显著高于对照组(P<0.05),完全缓解患者的CD3-CD56^+NK细胞/淋巴细胞、Tim3^+/CD3-CD56^+NK均显著高于初诊时检测值(P<0.05),其中化疗疗程≥2个、缓解时间>3个月患者的CD3-CD56^+NK细胞/淋巴细胞、Tim3^+/CD3-CD56^+NK分别显著高于化疗疗程1个、缓解时间≤3个月患者(P<0.05),完全缓解时的外周血CD56dimNK细胞/CD3-CD56^+NK细胞、Tim3表达水平均显著高于初诊时(P<0.05),完全缓解时的外周血CD56brightNK细胞/CD3-CD56^+NK细胞、Tim3表达水平均显著低于初诊时(P<0.05),Tim3^+NK细胞的IFN-γ分泌水平显著低于Tim3-NK细胞(P<0.05)。结论:共刺激分子Tim3在AML患者NK细胞及其亚群上的表达下调。

BTLA、LAG3和TIM3在上皮性卵巢癌组织中的表达意义

目的探讨B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)及T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM3)在上皮性卵巢癌组织中的表达情况及与其预后的关系。方法采用免疫组化PV法检测80例上皮性卵巢癌,38例良性上皮性卵巢肿瘤,12例交界性上皮性卵巢肿瘤及30例正常卵巢组织中的BTLA、LAG3及TIM3的表达情况,并分析其与卵巢癌临床病理指标的相关性;对卵巢癌患者进行术后随访,分析BTLA、LAG3、TIM3与预后的关系。结果 BTLA、LAG3、TIM3在正常卵巢组织,上皮性良性卵巢肿瘤,上皮性交界性卵巢肿瘤,和上皮性卵巢癌中表达情况存在明显差异,且呈上升趋势(P <0.001)。LAG3与卵巢癌分期、病理分级、淋巴结转移情况呈正相关(P <0.05);BTLA、TIM3与卵巢癌病理分期,淋巴结转移情况呈正相关(P <0.05);Kaplan-Meier寿命表法生存分析显示,BTLA、LAG3、TIM3表达阳性患者的生存曲线明显低于表达阴性组(P <0.05)。单因素分析法显示,BTLA、LAG3及TIM3阳性表达,FIGO分期中晚期,有淋巴结转移者的患者生存时间较BTLA、LAG3及TIM3阴性表达,FIGO分期早期,无淋巴结转移的明显缩短;多因素回归分析显示,BTLA、LAG3、TIM3的阳性表达及淋巴结转移是上皮性卵巢癌患者的生存独立危险因素。结论 BTLA、LAG3及TIM3在上皮性卵巢癌组织中呈高表达,其不同程度的表达增强与上皮性卵巢癌的发生、发展及预后有关,BTLA、LAG3及TIM3免疫抑制可抑制肿瘤生长。

靶向人TIM3单抗制备及对肝癌细胞增殖的影响

目的:制备靶向人TIM3的单克隆抗体,为药物研发奠定基础。方法:筛选人TIM3抗原表位,合成KLH多肽免疫小鼠,高效价鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,间接ELISA鉴定筛选后扩大培养,收获上清液测定亚型,辛酸-硫酸钙沉淀法纯化,MTT法检测其抑制肝癌细胞体外增殖的活性。结果:获得一株分泌高效价的抗TIM3单抗的细胞株,命名为FD12。抗体亚型为IgGkappa链,体外具有抑制肝癌细胞增殖的活性。结论:获得了具有抑癌活性的抗TIM3抗体。

非小细胞肺癌患者腺苷A2A受体和TIM3的表达及其与患者预后的关系分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者腺苷A2A受体(A2AR)和TIM3的表达及其与患者免疫功能的关系。方法采用免疫组织化学法检测65例NSCLC患者肺癌组织及其癌旁组织中的腺苷A2A受体和TIM3蛋白表达,并分析NSCLC组织腺苷A2A受体和TIM3蛋白表达与其预后的关系。结果肺癌组织腺苷A2A受体和TIM3蛋白表达率均高于癌旁组织(P<0.05)。腺苷A2A受体和TIM3蛋白阳性表达患者的复发率、淋巴结转移率较高,5年生存率较低(P<0.05)。Logistic多因素分析结果显示,NSCLC肺癌组织腺苷A2A受体和TIM3蛋白阳性表达率与其复发率、淋巴结转移率和5年生存率均相关。结论 NSCLC患者腺苷A2A受体和TIM3蛋白阳性表达率高且与其预后相关,可作为NSCLC患者预后评估的参考指标。

急性髓系白血病患者NK细胞及其亚群共刺激分子Tim3的表达

目的探讨共刺激分子Tim3在急性髓系白血病患者NK细胞及其亚群上的表达。方法随机选取医院2018年8月至2019年8月收治的急性髓系白血病患者30例作为研究组,另随机选取同期健康体检人员30例作为对照组。结果研究组患者的外周血CD56dimNK细胞/CD3-CD56+NK细胞、Tim3表达水平均显著低于对照组(P<0.05),外周血CD56brightNK细胞/CD3-CD56+NK细胞、Tim3表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论共刺激分子Tim3在急性髓系白血病患者NK细胞及其亚群上的表达下调。

免疫抑制剂对人外周血CD4^+和CD8^+ T细胞Tim3表达的影响及意义

目的:观察4种免疫抑制剂对正常人外周血中CD4+和CD8+细胞Tim3表达的影响。方法:选取6名正常志愿者外周血各30 ml,分离淋巴细胞,PHA刺激淋巴细胞增殖,按照免疫抑制剂分为CsA、MMF、FK506、RAPA及DMX单因素组和混合干预组,培养3 d后,流式细胞仪检测CD4+和CD8+细胞的Tim3表达,并在72h后检测各种干预因素作用后的细胞增殖情况。结果:在CD4+T细胞中,各单因素干预组Tim3+的阳性率与未干预组相比有显著差异(P<0.05),Tim3+最低的是CsA组和RAPA组,但无统计学差异;最高的是DMX组,与其它单因素4组比较有显著差异(P<0.05);复合干预组中,Tim3+最低的是CsA+RAPA+DMX组和RAPA+MMF+DM组,但无统计学差异。在CD8+T细胞中,各单因素干预组Tim3+的变化与未干预组相比,只有CsA组和RAPA组与对照组比较有统计学差异,两者间无统计学差异(P=0.511);而各个复合干预组与未干预组比较都有统计学差异,Tim3+最低的是CsA+RAPA+DMX组和RAPA+MMF+DM组,但无统计学差异(P=0.413);而最高的CsA+MMF+DMX组与CsA+RAPA+DMX和RAPA+MMF+DMX组比较有统计学差异(P分别为0.002和0.015)。在细胞增殖的结果中,各个干预组对外周血单个核细胞的增殖都有明显的抑制作用,CsA+RAPA+DMX组跟其它复合组比较有统计学差异(P<0.05)。结论:不同的免疫抑制剂对Tim3分子的表达存在差异,无论是细胞亚型还是增殖结果都明显不同。

生产抗Tim3单抗CHO细胞N-1灌流高密度培养工艺研究

通过开发高表达量、高效率重组人源化靶向Tim3的单克隆抗体细胞培养工艺,来显著降低Tim3抗体生产成本,提升药品市场可及性。本研究对CHO细胞N-1种子灌流培养工艺和生产抗Tim3单抗CHO细胞高密度培养工艺进行小试工艺开发,实现了高效细胞培养抗体生产。结论:基于交替切向流动过滤(ATF)的灌注过程,N-1种子细胞密度可达53×10^(6)cells/mL;接种至终反应器后进行超高接种密度(uHSD)的补料分批生产,细胞跳过适应期直接进行对数增殖,2 d后细胞便进入稳定期进行蛋白高效表达。对比常规补料分批式生产,细胞周期由14 d缩短为8 d,产品表达量由3.51 g/L提升至5.68 g/L,产品关键质量参数与原始工艺高度类似,生产效率提升3倍左右。研究初步表明,采用对CHO细胞N-1种子灌流培养工艺对抗Tim3单抗CHO细胞高密度培养工艺进行小试工艺开发,实现了高效细胞培养抗体生产。

包虫病患者血清中可溶性Tim3/Galectin9水平的表达及临床意义

目的:研究包虫病患者血清中可溶性T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子3(Tim3)/半乳糖凝集素9(Galectin9)水平的表达及临床意义。方法:选取2015年2月至2016年12月于我院接受治疗的包虫病患者40例作为包虫病组,另选取同期于我院接受体检的健康志愿者40例作为健康对照组,采用酶联免疫吸附法检测两组人员的血清Tim3、Galectin9、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)水平,并分析包虫病患者血清Tim3、Galectin9水平与IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6之间的相关性。结果:包虫病组患者血清Tim3、Galectin9水平均明显高于健康对照组(P<0.05)。包虫病组患者血清IFN-γ、TNF-α较健康对照组明显更低,而IL-4、IL-6水平较健康对照组明显更高(P<0.05)。经Pearson相关性分析可得:包虫病患者血清Tim3、Galectin9水平与血清IFN-γ、TNF-α均呈负相关关系,而与IL-4、IL-6水平均呈正相关关系(P<0.05)。结论:包虫病患者血清可溶性Tim3/Galectin9水平异常升高,其主要作用机制可能与影响细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6水平变化有关,在包虫病的发生、发展过程中起着重要的作用。

益气脱敏汤通过Tim3调控变应性鼻炎Th1/Th2机制研究

目的:探讨益气脱敏汤通过对变应性鼻炎(AR)患者Tim3蛋白的影响,使Th1细胞改变,从而引起Th1/Th2平衡变化,以达到治疗本病的作用。方法:AR患者随机分为中药组(益气脱敏汤组)和西药组(氯雷他定组),各20例,服药前后观察病情变化情况,再采集血标本。同时选择正常组20例,最后检测IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5细胞因子和Th1/Th2流式的结果,用Western Bolt检测Tim3蛋白,用RT-PCR检测Tim3 m RNA,进行统计分析。结果:(1)AR患者Tim3 m RNA表达上升,Tim3蛋白表达上升、Th1细胞数量下降、Th2细胞数量升高、Th1/Th2值下降(P<0.01)。IL-2和IFN-γ下降、IL-4和IL-5升高。(2)益气脱敏汤治疗后Tim3 m RNA表达下降、Tim3蛋白表达下降、Th1细胞数量升高、Th2细胞数量下降、Th1/Th2值升高、IL-2和IFN-γ升高、IL-4和IL-5下降(P<0.01)。结论:益气脱敏汤治疗AR可能通过抑制Tim3 m RNA和Tim3蛋白表达,负向调节使Th1细胞、IL-2和IFN-γ表达升高,正向调节使Th2、IL-4和IL-5表达量下降,调节Th1/Th2平衡恢复正常水平,改善机体免疫状态,从而使AR症状得到缓解。