VP22的细胞间传递作用对HSV-tk/GCV的肿瘤细胞杀伤促进效应

目的 :探讨VP2 2的细胞间传递作用对HSV tk/GCV杀伤肿瘤细胞的促进作用。方法 :将VP2 2与报告基因 绿色荧光蛋白基因 (GFP)或前药酶基因 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk)构建在同一载体上 ,进行DNA序列分析鉴定 ;将此融合基因载体转染 2 93T或COS7细胞 ,免疫荧光分析确定转染情况和细胞间传递作用 ;在前药GCV不同浓度、转染与未转染细胞比例不同时 ,MTT法检测细胞增殖情况 ;利用转染细胞培养液上清培养未转染细胞 ,确定旁观者效应是否由培养液转移。结果 :PCR及序列分析显示融合基因插入载体正确 ;对 2 93T或COS7细胞转染率可达 2 5 %～ 3 0 % ,且证明融合蛋白已被表达并在细胞间传递 ;HSV tk与VP2 2融合后在前药GCV浓度低至 0 .1μg/ml时就可显示出细胞杀伤效应增强 ,并随着表达VP2 2 HSV tk细胞比例的增加 ,细胞杀伤作用增强。结论 :VP2 2介导的自杀基因产物的细胞间传递作用可解决自杀基因的低效细胞毒作用 ,明显增强细胞杀伤效应。

Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应

目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。

鸭瘟病毒TK基因及其编码蛋白的生物信息学分析

运用生物信息学方法,对鸭瘟病毒TK基因的基本元件和TK蛋白的理化性质、结构、功能进行分析。明确了TK基因启动子、转录起始位点、编码区P、olyA的位置;发现TK蛋白的二级结构以α螺旋为主,属于混合型蛋白,在结构和功能上与疱疹病毒胸苷激酶高度相似。生物信息学分析结果说明,鸭瘟病毒TK蛋白具有疱疹病毒胸苷激酶的活性,鸭瘟病毒TK基因可能为鸭瘟病毒的非必需毒力基因。

鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与生物信息学分析

本研究根据Gen Bank上发表的鸭瘟病毒(DPV)基因序列设计了1对引物,分别对DPV AV 1221株和DPV鸡胚化弱毒疫苗株的TK基因进行扩增,扩增的目的片段克隆至载体p MD19-T,经PCR和双酶切(Bam HⅠ+HindⅢ)鉴定,将阳性质粒进行测序和生物信息学分析。结果成功克隆出了长度均为1 077 bp的DPV TK基因,生物信息学分析结果表明两个片段的同源性达到100%。

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建

目的建立既有TK活性又表达绿色荧光的融合蛋白治疗系统用于实验研究,为建立荧光活体成像技术,更为科学地进行肿瘤自杀基因增效中药成分的研究打下基础。方法DNA重组技术构建HSV1-TK cDNA与EGFP基因融合的真核细胞表达载体pTKGFP,用酶切鉴定并进行序列测定;polyFect转染液对鼠黑色素瘤细胞B16进行转染,荧光显微镜观察基因表达情况,MTT法检测转化细胞B16对GCV的敏感性。结果重组质粒pTKGFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,TK基因已经成功与GFP基因连接,连接处无移码突变产生;荧光显微镜下观察显示,TK-GFP融合基因在B16中获得表达。其在细胞中的定位与文献资料一致,TKGFP主要集中于胞核区而GFP弥散分布于胞质中。TKGFP组细胞对GCV的敏感性大于对照组细胞,差异有显著性。结论构建了pTKGFP融合蛋白基因表达载体,并成功在B16中进行表达,所表达的融合蛋白具有TK活性和GFP的荧光活性,可用于后续性的体外与体内实验。

表达非洲猪瘟病毒外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株的构建

为了构建表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株并研究其生物学特性,试验利用RED/ET同源重组技术和ccdB反向筛选技术将EP402R pUC57-CMV-Flag-EP402R-BGH质粒(EP402R序列来源Georgia 2007/1株,GenBank登录号为FR682468)的EP402R基因片段替换掉pBeloBAC11-Bartha-K61载体中的TK基因片段,构建pBeloBAC11-Bartha-K61-(TK)CMV-Flag-EP402R-BGH重组质粒;再将该重组质粒转染至Vero细胞中进行病毒拯救,通过观察细胞病变、PCR方法和Western-blot鉴定得到重组伪狂犬毒株rBartha-K61-EP402R,并对其稳定性和增殖特性进行研究。结果表明:构建的重组伪狂犬毒株连续传代20次后仍能检测到EP402R基因和Flag标签蛋白;重组伪狂犬毒株与亲本毒株的增殖曲线保持一致,且病毒效价峰值可达到1×10^(5.6)TCID_(50)/mL。说明试验成功构建了表达ASFV外膜蛋白CD2v的重组伪狂犬毒株,且该毒株具有良好遗传稳定性和增殖性能。

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。

用于筛选化学预防剂的报告载体的构建

构建以TK为基本启动子,其上游由抗氧化反应元件(ARE)调控的报告载体pARE-TK-GFP以期用于化学预防剂的筛选.应用重组PCR技术,分别经3次PCR获得重组TK启动子并克隆入pMD18-T载体中,经酶切和测序鉴定正确后连入pEGFP中构建载体pTK-GFP.人工合成的ARE插入TK基本启动子上游,成功构建报告载体pARE-TK-GFP.脂质体转染HepG2细胞并在荧光显微镜下观察有绿色荧光.该载体的成功构建可为各种天然或人工合成的化学预防剂的筛选奠定基础.

VP22增强慢病毒介导的自杀基因治疗抑制人卵巢癌裸鼠腹腔种植瘤生长的研究

目的:探讨单纯疱疹病毒壳膜蛋白VP22的细胞间传递作用促进HSV-TK/GCV(单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦)系统对卵巢癌腹腔移植瘤的杀伤效应。方法:将慢病毒包装质粒、包膜质粒、转移载体质粒采用磷酸钙沉淀法共转染包装细胞293T,收集病毒上清,并建立人上皮性卵巢癌(3AO)细胞株腹腔移植瘤模型。单药组分为TK+生理盐水(NS)组、VP22-TK+NS组、NS+NS组,分别腹腔注射慢病毒TK、VP22-TK或NS1ml,继而腹腔注射NS;联合用药组分为TK+GCV组、VP22-TK+GCV组、NS+GCV组分别腹腔注射慢病毒TK、VP22-TK及NS,24h后腹腔注射GCV治疗。每组裸小鼠均为5只。观察各组裸鼠的生存时间及慢病毒的毒性作用。结果:平均生存时间TK+NS组、VP2-TK+NS组、NS+NS组、NS+GCV组、TK+GCV组、VP2-TK+GCV组分别为18.3±2.7d、18.4±1.9d,17.2±1.3d、18.7±1.9d、21±4d和46±22d,6组差异有显著性(χ2=24.81,P=0.002);并且VP2-TK+GCV组平均生存时间较TK+GCV组裸鼠明显延长(χ2=7.42,P=0.006)。结论:VP22介导的自杀基因产物的细胞间扩散作用可明显加强对体内肿瘤细胞的杀伤效应。

泸定百合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(LsS/TK)的克隆与表达分析

本研究根据从之前已构建的百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的一个S/TK EST序列,通过RACE结合RT-PCR技术克隆到1个泸定百合S/TK基因全长cDNA序列,该基因全长2016 bp,开放阅读框长1440 bp,编码479个氨基酸,命名为LsS/TK。保守域结构分析表明Ls S/TK具有典型的S/TK激酶保守亚结构域。进化树分析结果显示LsS/TK与拟南芥的APTK19的进化关系最近,而与其它植物的S/TK的进化关系都较远。实时定量PCR结果显示百合镰刀菌诱导后LsS/TK表现上调表达,推测该基因可能在一定程度上参与泸定百合抗镰刀菌病害途径。

基于抗氧化反应元件的转基因细胞模型的建立

建立基于抗氧化反应元件(ARE)调控的GFP报告基因细胞模型。首先用PCR法扩增TK基本启动子克隆到pEGFP-N1上,构建pTK-GFP/Neo报告载体,再将人工合成的4个ARE重复序列依次插入到pTK-GFP/Neo载体的TK启动子上游,构建成ARE调控的真核报告载体p4ARE-TK-GFP/Neo,将该载体用脂质体转染法转染人HepG2肝癌细胞,经G418筛选,获得阳性克隆。扩增后经Ⅱ相代谢酶诱导物PDTC和tBHQ实验验证。结果表明:细胞发光度与诱导物有明显剂量效应关系,成功建立了基于抗氧化反应元件的转基因细胞模型。

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.