长春花碱和秋水酰胺诱导TK6和TK6-E6细胞TK基因突变比较研究

目的比较TK6和TK6-E6人类淋巴母细胞TK基因突变试验对2种纺锤体毒物——长春花碱(VBL)和秋水酰胺(CCM)检出情况的差异。方法用长春花碱和秋水酰胺处理TK6和TK6-E6细胞24小时,进行常规TK基因突变试验,检测细胞毒性及tk位点突变频率。结果随着长春花碱和秋水酰胺浓度的增加,TK6和TK6-E6细胞的相对存活率(RS%)和相对悬浮生长率(RSG%)均降低。相同剂量下,TK6-E6细胞的RS%和RSG%均比TK6高。长春花碱和秋水酰胺对TK6和TK6-E6细胞均有致突变性,TK6-E6细胞的诱发和自发突变频率高于TK6,而除了突变频率(MF)中CCM5·0ng/ml组和SC%中CCM0·625ng/ml组外,其它相同剂量下,TK6-E6的MF和慢生长集落百分比(SC%)均高于TK6细胞(P<0·05)。结论两种细胞都可用于TK基因突变试验,但由于TK6-E6所用细胞量少,倍增时间较短,故建议使用TK6-E6细胞。

TK6细胞tk基因突变试验检测甲基磺酸甲酯的诱变性

本研究通过用标准诱变剂甲基磺酸甲酯(MMS)处理TK6细胞 ,对培养物进一步作tk位点突变测试 ,以及细胞p5 3基因蛋白表达水平的检测 .结果表明 ,MMS可诱导TK6细胞tk位点的突变 ,诱发突变是自发突变的 2～ 7倍 .在tk位点诱发了两种不同表型的突变集落 :即正常生长突变体 (tk NGmutant)和慢生长突变体 (tk SGmutant) .但以慢生长突变体为主 .MMS处理后 ,TK6细胞P5 3蛋白的表达水平增高 .本研究为将TK6细胞应用于我国tk基因突变的毒理学评价和机理的研究提供了实验依据 .

微囊藻毒素MCLR导致TK6细胞tk位点杂合性丢失的分析

目的:应用人类淋巴母细胞TK6研究微囊藻毒素Microcystin -LR (MCLR)的体外遗传毒性分子机理。方法:藻毒素MCLR (80 μg/ml)体外染毒TK6细胞2 4h后检测tk位点突变频率并进行TK基因缺失突变体LOH的分析。结果:MCLR染毒导致TK6细胞相对存活率下降,TK基因突变频率明显上升,达到对照的5 1倍。MCLR诱导产生半合子LOH(41 7% )的比例是对照(2 0 7% )的两倍。结论:体外2 4h染毒TK6细胞MCLR可致突变并表现出断裂剂特性,诱发杂合性丢失而非点突变。

L5178Y与TK6细胞的TK基因突变实验比较

目的 比较 L 5 178Y与 TK6细胞在 TK基因突变试验系统中的异同和优劣。方法 采用 L 5 178Y和TK6细胞做 TK基因突变试验微孔平板法 ,对四种受试物 (MMS、EMS、MMC、KCl)的致突变性进行检测与评价。结果 两种细胞对四种受试物的检测结果基本一致 ,但 TK6细胞对四种受试物的耐受性均低于 L 5 178Y细胞 ,且相对突变指数显著高于 L 5 178Y细胞。结论 两种细胞应用于本试验各有其优越性 ,但由于 TK6细胞来自于人类 ,实际应用意义大于 L 5 178Y细胞 ,建议推广 TK

长春花碱3和24h处理TK6细胞TK基因突变试验比较研究

[目的]比较用长春花碱对人淋巴母细胞TK6处理3h和24h的诱变性。[方法]用长春花碱对TK6细胞分别进行3h和24h染毒处理,用微孔板法进行TK基因突变试验。计算TK6细胞的接种效率(PE)、相对存活率RS、相对悬浮增值率RSG、总的相对增长率RTG、突变频率MF。[结果]在3h处理条件下,随长春花碱浓度的增加,RS、RTG和RSG等均降低,中、高剂量水平已表现出明显的细胞毒性,但各剂量水平的MF与溶剂对照比较差异均有统计学意义(P﹤0.05);在24h处理条件下,其MF随VBL浓度的增加而增加,并有一定的剂量-反应关系。[结论]较长时间处理对于长春花碱等细胞周期依赖性的毒物是必要的。

姜黄素对TK6细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用研究

目的 : 观察姜黄素 (curcumin)对人的类淋巴母细胞 TK6细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用 ,为进一步探讨其抗诱变、抗肿瘤的机制和开发利用提供理论依据。方法 : 姜黄素处理TK6细胞 ,采用 MTT比色分析法、3 H- Td R掺入法和细胞周期测定以及细胞超微结构观察和流式细胞分析。结果 : 2 0 μmol/L的姜黄素处理细胞 2 4 h,即可产生显著的细胞增殖抑制作用和凋亡诱导作用 ,且有剂量和时间依赖性。姜黄素引起细胞的凋亡主要在细胞周期的 DNA合成期 (S期 ) ,将细胞周期阻滞在静止期和 DNA合成前期 (G0 /G1期 )。结论 : 姜黄素对 TK6细胞具有显著的增殖抑制作用和凋亡诱导作用。

TK6和WTK1细胞体外微核试验比较研究

目的:比较5种诱变剂诱导人类淋巴母细胞TK6和WTK1的微核反应。方法:用人的类淋巴母细胞TK6和WTK1进行体外微核试验,评价5种诱变剂的染色体损伤效应。结果:5种受试物均可诱导两种细胞微核率显著升高,但在大多数剂量和采样时间,受试物诱导的TK6细胞微核率均不同程度地高于WTK1细胞微核率。结论:TK6细胞对受试物诱导的染色体损伤更为敏感。

环磷酰胺诱导TK6细胞TK基因杂合性丢失的实验研究

目的 应用人类淋巴母细胞TK6研究环磷酰胺(CP)遗传毒性分子机理。方法 CP+S9体外染毒TK6细胞4 h后检测细胞相对存活率、tk位点突变频率并进行TK基因缺失突变体杂合性丢失(L OH)的分析。结果 环磷酰胺染毒导致TK 6细胞相对存活率下降,TK基因突变频率上升,并呈现剂量-反应关系。正常及缓慢生长突变集落倍增时间分别为(14 .6±1.74 ) h及(35 .8±3.78) h。环磷酰胺诱导产生半合子L OH的比例(5 0 % )是对照(2 0 .7% )的2 .4倍。结论 环磷酰胺对TK基因较大范围的损伤是导致基因突变的主要原因。

长春花碱诱导TK6细胞tk位点杂合性丢失的研究

目的建立用人类淋巴母细胞TK 6检测纺锤体毒物——长春花碱的TK基因突变试验方法,同时探讨长春花碱的遗传毒性分子机理。方法使用长春花碱0.625 ng/mL、1.250 ng/mL、2.500 ng/mL和5.000 ng/mL对TK 6细胞染毒24 h,进行TK基因突变试验。检测细胞相对存活率(RS%)、相对悬浮增长率(RTG%)、tk位点突变频率(M F)和缓慢生长集落的百分比(SC%),同时对突变集落tk位点杂合性丢失(LOH)进行分析。结果随着长春花碱浓度的增加,TK 6细胞的相对存活率和相对悬浮增长率均降低,而tk位点突变频率逐渐增加,且有剂量反应关系。tk位点杂合性分析表明长春花碱诱发的突变集落中有96.4%为LOH丢失,其中半合子LOH为39.3%,纯合子LOH为57.1%。结论长春花碱可诱导TK 6细胞tk基因突变,主要以LOH为主。

TK6和WTK1细胞对H_2O_2诱导的DNA损伤和修复能力的比较

目的 探讨人的近二倍体类淋巴母细胞 TK6和 WTK1细胞的 DNA损伤和修复能力的差异和机制。方法 采用 2 5μmol/ L、5 0μmol/L、10 0μmol/L的 H2 O2 分别处理 TK6和 WTK1细胞 ,对两种细胞进行单细胞凝胶电泳 ,检测 TK6和 WTK1细胞的彗星细胞率和彗星细胞尾长以及 p5 3基因的蛋白表达。结果 TK6细胞对 H2 O2 诱导的 DNA损伤具有较高的敏感性 ,具有更为快速有效的损伤后修复能力。在孵育 0 .5 h至 1h内两种细胞达最大有效修复。TK6细胞 P5 3蛋白本底水平明显低于 WTK1细胞 ,在 H2 O2 处理后 ,其表达水平明显增强。结论 TK6细胞对 H2 O2 诱导的 DNA损伤更为敏感 ,损伤后的修复更为快速、有效。p5 3基因的表达水平的差异是两种细胞 DNA损伤和修复能力差异的重要机制。

人类淋巴母细胞TK6检测环磷酰胺诱发微核及TK基因突变的体外实验研究

目的建立TK6细胞检测环境诱变剂诱发微核及TK基因突变的实验方法。方法用诱变剂环磷酰胺(CP)体外染毒TK6细胞4h后检测细胞毒性,微核及tk位点突变频率。结果CP处理导致TK6细胞的相对存活率下降,细胞微核率及TK基因突变频率明显上升,并均有剂量-反应关系。最高浓度组(4.0μg/ml)的细胞微核率及TK基因突变频率分别是对照组的8.8和15.7倍。CP诱发tk位点两种不同表型的突变细胞集落,即正常生长突变体集落及缓慢生长突变体集落,并以后者为主。结论CP可以诱发TK6细胞微核及TK基因突变,揭示CP可能是一种断裂剂。TK6细胞可用于评估环境化学物细胞水平遗传改变及TK基因突变。

TK6和WTK1细胞tk位点突变敏感性的比较研究

目的 比较研究 2种起源于人类的tk+ - 杂合子细胞TK6和WTK1细胞对化合物———甲基磺酸甲酯(MMS)诱发tk位点突变的敏感性 ,为tk位点突变敏感细胞株的筛选提供实验依据。方法 用标准诱变剂MMS处理TK6和WTK1细胞 ,对培养物进一步作tk位点突变测试 ,以及细胞p5 3基因蛋白表达水平的检测。结果 MMS可诱导TK6和WTK1细胞tk位点的突变 ,其诱发突变分别是自发突变的 2～ 7倍和 3～ 10倍。WTK1细胞对MMS的细胞毒作用具有较大的抗性。MMS的作用下 ,WTK1细胞的突变频率分别是TK6细胞的 15 7、19 0和 2 0 4倍。在tk位点诱发了 2种不同表型的突变集落 ,但以慢生长突变体为主。无论是自发突变还是MMS的诱发突变 ,WTK1细胞的突变频率均显著地高于TK6细胞。经MMS处理后 ,TK6细胞p5 3蛋白的表达水平增高更为明显。结论 WTK1细胞是更为敏感的tk基因突变试验检测细胞株。MMS诱发的突变有染色体畸变和基因突变 。

siRNA干扰Nrf2基因对铅染毒TK6细胞凋亡和氧化应激的影响

目的研究应用siRNA抑制Nrf2基因表达后对乙酸铅染毒所致TK6细胞凋亡和氧化应激的影响。方法体外培养TK6细胞,设正常组、阴性对照组及Nrf2-siRNA1、Nrf2-siRNA2、Nrf2-siRNA3转染组。Western blot验证转染效果,筛选出干扰效果最佳序列。采用480μmol/L的乙酸铅染毒TK6细胞,运用流式细胞技术、2’,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色分析、高度水溶性四唑盐(WST-1)法技术检测TK6细胞凋亡、细胞内活性氧(ROS)含量和细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果正常组、阴性对照组、Nrf2-siRNA1转染组、Nrf2-siRNA2转染组、Nrf2-siRNA3转染组细胞Nrf2蛋白表达水平分别为1.00±0.08、0.96±0.07、0.71±0.05、0.58±0.07、0.20±0.07,差异有显著统计学意义(F=29.361,P<0.01),其中Nrf2-siRNA3转染组的Nrf2蛋白表达水平低于其他四组细胞,故选用Nrf2-siRNA3转染组进行后续实验;经乙酸铅染毒TK6细胞24 h后,Nrf2-siRNA3转染组细胞凋亡率为(26.8±2.13)%,与正常组的(8.5±1.79)%及阴性对照组的(9.0±2.02)%比较,差异均有显著统计学意义(P<0.01);Nrf2-siRNA3转染组细胞内ROS探针荧光强度为21 621±345,与正常组的14 141±289及阴性对照组的14 694±301比较差异均有显著统计学意义(P<0.01);Nrf2-siRNA3转染组细胞SOD含量为(13.3±2.8) U/mg·prot,与正常组的(34.6±3.3) U/mg·prot及阴性对照组的(31.9±3.2) U/mg·prot比较差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。结论 Nrf2基因表达受抑制后,TK6细胞对铅毒性的敏感性增强,TK6细胞凋亡率增加和抗氧化损伤能力下降。

基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立

目的:建立基于人成淋巴TK6细胞的体外磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)基因突变试验方法,研究甲基磺酸乙酯(EMS)与苯并芘(B[a]P)诱导TK6细胞PIG-A 基因突变的能力,并探讨该方法用于药物开发初期遗传毒性筛选和评价的前景。方法:通过免疫磁珠分离清除TK6细胞株中预先存在的GPI(-)细胞(即PIG-A 基因突变细胞),然后连续40 d测定正常传代培养TK6细胞PIG-A 基因的自发突变率。设不添加体外代谢活化系统长时处理组(24 h -S9)和添加体外代谢活化系统短时处理组(4 h +S9),并分别采用3个不同浓度50、75、100 μmol/L的EMS和4、8、16 μmol/L的B[a]P处理TK6细胞10 d,在第11天收获细胞。使用CD19、CD55、CD59抗体和核酸染料7-AAD对细胞进行标记,然后用流式细胞仪分析CD19阳性细胞中,CD55和CD59表达阴性的细胞频率。结果:经过免疫磁珠分离,TK6细胞中预先存在的PIG-A 基因突变细胞频率降低至2.5×10-5。连续测定40 d TK6细胞的PIG-A 基因自发突变率,计算得到其自发突变率为5.04×10-7个/d。与阴性对照组比较,不同浓度EMS和B[a]P诱导产生的PIG-A 基因突变细胞比例均呈剂量依赖性增加,并超过阴性对照组的2倍以上。结论:本研究初步建立了基于TK6细胞的体外PIG-A 基因突变检测方法。该方法成本较低,简便、快速,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。

TK6人类淋巴母细胞TK突变体生长慢相关基因分离和鉴定

目的:分离TK6人类淋巴母细胞慢生长突变体中与慢生长表型相关的基因并进行初步功能鉴定。方法:根据目标基因与胸苷激酶(Thymicline kinase,TK)基因连锁的特性,采用人类全基因组表达芯片检测全基因的表达情况,由此确定慢生长相关基因的位置和表达性质,以缩小筛选范围,最后通过基因功能检索,确定目标基因,并通过RT-PCR对目标基因进行初步验证。结果:慢生长细胞整体表达水平下调,但少数染色体尤其以17号染色体局部区域呈高表达状态。而在TK位点到端粒这一区域,TK以及毗邻的染色盒同源物(Chromobox homoloy,CBX2),CBX4,CBX8均呈高表达状态,功能检索发现CBX与转录抑制有关,功能验证实验中CBX4表达水平与细胞倍增时间呈正向相关。结论:TK6慢生长表型与17号染色体q臂近端粒位置的CBX基因相关,但仍需更多证据确认CBX是慢生长表现最直接相关的基因。

Ligase4缺失对芹菜素抑制TK6细胞增殖作用的影响

目的:研究非同源末端连接修复基因Ligase4缺失对芹菜素(APG)抑制TK6细胞增殖作用的影响。方法:采用CCK8方法检测APG和阳性药依托泊苷(ETP)对TK6细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测APG对TK6细胞周期和凋亡的影响;利用免疫荧光实验分析APG对野生型(WT)和DNA损伤修复缺陷的Ligase4-/-细胞的DNA损伤作用。结果:APG对TK6细胞的增殖抑制作用呈现剂量依赖性;APG能将TK6细胞阻滞在G2/M期并诱导TK6细胞凋亡;经80μmol·L^-1APG处理细胞后,Ligase4-/-型细胞的γ-H2AX foci相对于WT细胞明显增加,在6 h达到峰值(P<0. 05)。结论:APG能抑制TK6细胞的增殖,并且对非同源末端连接修复基因Ligase4缺失的细胞造成的DNA损伤更严重且抑制细胞增殖作用更强。

氢醌诱导TK6细胞miR-221表达异常致PARP-1基因下调的机制

目的探讨氢醌(HQ)致TK6细胞PARP-1基因表达下调的机制。方法以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0和10.0μmol/L HQ染毒TK6细胞为染毒组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测miR-221的表达改变,以蛋白印迹法检测PARP-1蛋白表达量,以生物信息学方法分析miR-221的潜在甲基化相关靶基因。结果与对照组相比,2.5、5.0和10.0μmol/L HQ组细胞PARP-1蛋白量逐渐下降,5.0和10.0μmol/L HQ组miR-221表达量分别下降17%(P<0.05)、42%(P<0.05)。miR-221能与MBD2 mRNA的3’非翻译区(UTR)形成调控复合体。结论 HQ致PARP-1基因下调机制可能与miR-221表达异常有关。

低剂量氢醌对TK6淋巴母细胞生物学性状及miR-221表达影响

目的探讨低剂量氢醌(HQ)对TK6淋巴母细胞的生物学性状及小分子非编码RNA(microRNA)-221(miR-221)表达的影响。方法磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0和10.0μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组。应用CCK-8试剂盒检测细胞活力和细胞增殖,通过磷脂结合蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(PI)标记的流式细胞技术检测细胞凋亡,用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-221的表达改变。结果细胞增殖以48 h最为明显,2.5、5.0和10.0μmol/L组细胞增殖指数分别为1.33(P<0.05)、1.14(P<0.05)和1.12(P<0.05);miR-221表达改变以72 h最为明显,2.5、5.0、10.0μmol/L HQ组细胞miR-221表达量分别抑制了0.31倍(P<0.05)、0.39倍(P<0.05)和0.33倍(P<0.05)。结论低剂量HQ能抑制TK6细胞凋亡和miR-221的表达,促进细胞增殖。