微囊藻毒素MCLR导致TK6细胞tk位点杂合性丢失的分析

目的:应用人类淋巴母细胞TK6研究微囊藻毒素Microcystin -LR (MCLR)的体外遗传毒性分子机理。方法:藻毒素MCLR (80 μg/ml)体外染毒TK6细胞2 4h后检测tk位点突变频率并进行TK基因缺失突变体LOH的分析。结果:MCLR染毒导致TK6细胞相对存活率下降,TK基因突变频率明显上升,达到对照的5 1倍。MCLR诱导产生半合子LOH(41 7% )的比例是对照(2 0 7% )的两倍。结论:体外2 4h染毒TK6细胞MCLR可致突变并表现出断裂剂特性,诱发杂合性丢失而非点突变。

TK6细胞tk基因突变试验检测甲基磺酸甲酯的诱变性

本研究通过用标准诱变剂甲基磺酸甲酯(MMS)处理TK6细胞 ,对培养物进一步作tk位点突变测试 ,以及细胞p5 3基因蛋白表达水平的检测 .结果表明 ,MMS可诱导TK6细胞tk位点的突变 ,诱发突变是自发突变的 2～ 7倍 .在tk位点诱发了两种不同表型的突变集落 :即正常生长突变体 (tk NGmutant)和慢生长突变体 (tk SGmutant) .但以慢生长突变体为主 .MMS处理后 ,TK6细胞P5 3蛋白的表达水平增高 .本研究为将TK6细胞应用于我国tk基因突变的毒理学评价和机理的研究提供了实验依据 .

姜黄素对TK6细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用研究

目的 : 观察姜黄素 (curcumin)对人的类淋巴母细胞 TK6细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用 ,为进一步探讨其抗诱变、抗肿瘤的机制和开发利用提供理论依据。方法 : 姜黄素处理TK6细胞 ,采用 MTT比色分析法、3 H- Td R掺入法和细胞周期测定以及细胞超微结构观察和流式细胞分析。结果 : 2 0 μmol/L的姜黄素处理细胞 2 4 h,即可产生显著的细胞增殖抑制作用和凋亡诱导作用 ,且有剂量和时间依赖性。姜黄素引起细胞的凋亡主要在细胞周期的 DNA合成期 (S期 ) ,将细胞周期阻滞在静止期和 DNA合成前期 (G0 /G1期 )。结论 : 姜黄素对 TK6细胞具有显著的增殖抑制作用和凋亡诱导作用。

环磷酰胺诱导TK6细胞TK基因杂合性丢失的实验研究

目的 应用人类淋巴母细胞TK6研究环磷酰胺(CP)遗传毒性分子机理。方法 CP+S9体外染毒TK6细胞4 h后检测细胞相对存活率、tk位点突变频率并进行TK基因缺失突变体杂合性丢失(L OH)的分析。结果 环磷酰胺染毒导致TK 6细胞相对存活率下降,TK基因突变频率上升,并呈现剂量-反应关系。正常及缓慢生长突变集落倍增时间分别为(14 .6±1.74 ) h及(35 .8±3.78) h。环磷酰胺诱导产生半合子L OH的比例(5 0 % )是对照(2 0 .7% )的2 .4倍。结论 环磷酰胺对TK基因较大范围的损伤是导致基因突变的主要原因。

长春花碱诱导TK6细胞tk位点杂合性丢失的研究

目的建立用人类淋巴母细胞TK 6检测纺锤体毒物——长春花碱的TK基因突变试验方法,同时探讨长春花碱的遗传毒性分子机理。方法使用长春花碱0.625 ng/mL、1.250 ng/mL、2.500 ng/mL和5.000 ng/mL对TK 6细胞染毒24 h,进行TK基因突变试验。检测细胞相对存活率(RS%)、相对悬浮增长率(RTG%)、tk位点突变频率(M F)和缓慢生长集落的百分比(SC%),同时对突变集落tk位点杂合性丢失(LOH)进行分析。结果随着长春花碱浓度的增加,TK 6细胞的相对存活率和相对悬浮增长率均降低,而tk位点突变频率逐渐增加,且有剂量反应关系。tk位点杂合性分析表明长春花碱诱发的突变集落中有96.4%为LOH丢失,其中半合子LOH为39.3%,纯合子LOH为57.1%。结论长春花碱可诱导TK 6细胞tk基因突变,主要以LOH为主。

人类淋巴母细胞TK6检测环磷酰胺诱发微核及TK基因突变的体外实验研究

目的建立TK6细胞检测环境诱变剂诱发微核及TK基因突变的实验方法。方法用诱变剂环磷酰胺(CP)体外染毒TK6细胞4h后检测细胞毒性,微核及tk位点突变频率。结果CP处理导致TK6细胞的相对存活率下降,细胞微核率及TK基因突变频率明显上升,并均有剂量-反应关系。最高浓度组(4.0μg/ml)的细胞微核率及TK基因突变频率分别是对照组的8.8和15.7倍。CP诱发tk位点两种不同表型的突变细胞集落,即正常生长突变体集落及缓慢生长突变体集落,并以后者为主。结论CP可以诱发TK6细胞微核及TK基因突变,揭示CP可能是一种断裂剂。TK6细胞可用于评估环境化学物细胞水平遗传改变及TK基因突变。

siRNA干扰Nrf2基因对铅染毒TK6细胞凋亡和氧化应激的影响

目的研究应用siRNA抑制Nrf2基因表达后对乙酸铅染毒所致TK6细胞凋亡和氧化应激的影响。方法体外培养TK6细胞,设正常组、阴性对照组及Nrf2-siRNA1、Nrf2-siRNA2、Nrf2-siRNA3转染组。Western blot验证转染效果,筛选出干扰效果最佳序列。采用480μmol/L的乙酸铅染毒TK6细胞,运用流式细胞技术、2’,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色分析、高度水溶性四唑盐(WST-1)法技术检测TK6细胞凋亡、细胞内活性氧(ROS)含量和细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果正常组、阴性对照组、Nrf2-siRNA1转染组、Nrf2-siRNA2转染组、Nrf2-siRNA3转染组细胞Nrf2蛋白表达水平分别为1.00±0.08、0.96±0.07、0.71±0.05、0.58±0.07、0.20±0.07,差异有显著统计学意义(F=29.361,P<0.01),其中Nrf2-siRNA3转染组的Nrf2蛋白表达水平低于其他四组细胞,故选用Nrf2-siRNA3转染组进行后续实验;经乙酸铅染毒TK6细胞24 h后,Nrf2-siRNA3转染组细胞凋亡率为(26.8±2.13)%,与正常组的(8.5±1.79)%及阴性对照组的(9.0±2.02)%比较,差异均有显著统计学意义(P<0.01);Nrf2-siRNA3转染组细胞内ROS探针荧光强度为21 621±345,与正常组的14 141±289及阴性对照组的14 694±301比较差异均有显著统计学意义(P<0.01);Nrf2-siRNA3转染组细胞SOD含量为(13.3±2.8) U/mg·prot,与正常组的(34.6±3.3) U/mg·prot及阴性对照组的(31.9±3.2) U/mg·prot比较差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。结论 Nrf2基因表达受抑制后,TK6细胞对铅毒性的敏感性增强,TK6细胞凋亡率增加和抗氧化损伤能力下降。

基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立

目的:建立基于人成淋巴TK6细胞的体外磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)基因突变试验方法,研究甲基磺酸乙酯(EMS)与苯并芘(B[a]P)诱导TK6细胞PIG-A 基因突变的能力,并探讨该方法用于药物开发初期遗传毒性筛选和评价的前景。方法:通过免疫磁珠分离清除TK6细胞株中预先存在的GPI(-)细胞(即PIG-A 基因突变细胞),然后连续40 d测定正常传代培养TK6细胞PIG-A 基因的自发突变率。设不添加体外代谢活化系统长时处理组(24 h -S9)和添加体外代谢活化系统短时处理组(4 h +S9),并分别采用3个不同浓度50、75、100 μmol/L的EMS和4、8、16 μmol/L的B[a]P处理TK6细胞10 d,在第11天收获细胞。使用CD19、CD55、CD59抗体和核酸染料7-AAD对细胞进行标记,然后用流式细胞仪分析CD19阳性细胞中,CD55和CD59表达阴性的细胞频率。结果:经过免疫磁珠分离,TK6细胞中预先存在的PIG-A 基因突变细胞频率降低至2.5×10-5。连续测定40 d TK6细胞的PIG-A 基因自发突变率,计算得到其自发突变率为5.04×10-7个/d。与阴性对照组比较,不同浓度EMS和B[a]P诱导产生的PIG-A 基因突变细胞比例均呈剂量依赖性增加,并超过阴性对照组的2倍以上。结论:本研究初步建立了基于TK6细胞的体外PIG-A 基因突变检测方法。该方法成本较低,简便、快速,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。

Ligase4缺失对芹菜素抑制TK6细胞增殖作用的影响

目的:研究非同源末端连接修复基因Ligase4缺失对芹菜素(APG)抑制TK6细胞增殖作用的影响。方法:采用CCK8方法检测APG和阳性药依托泊苷(ETP)对TK6细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测APG对TK6细胞周期和凋亡的影响;利用免疫荧光实验分析APG对野生型(WT)和DNA损伤修复缺陷的Ligase4-/-细胞的DNA损伤作用。结果:APG对TK6细胞的增殖抑制作用呈现剂量依赖性;APG能将TK6细胞阻滞在G2/M期并诱导TK6细胞凋亡;经80μmol·L^-1APG处理细胞后,Ligase4-/-型细胞的γ-H2AX foci相对于WT细胞明显增加,在6 h达到峰值(P<0. 05)。结论:APG能抑制TK6细胞的增殖,并且对非同源末端连接修复基因Ligase4缺失的细胞造成的DNA损伤更严重且抑制细胞增殖作用更强。

TK基因突变试验检测叶绿素的抗诱变性

目的:用人的类淋巴母细胞TK6的TK基因突变试验检测叶绿素的抗诱变性。方法:不加S9活化的条件下,用叶绿素10、20、40、80μg/ml与阳性致突变物丝裂霉素C(MMC)0.5μg/ml同时处理TK6细胞3 h,采用微孔板法进行平板接种效率和突变频率的测定。结果:随受试物剂量的增加,叶绿素对MMC诱变性的拮抗作用增大,当剂量达到40μg/ml以上时总突变频率较MMC组有显著降低(P<0.05)。结论:叶绿素具有拮抗MMC诱导的tk基因突变的作用。

用TK基因突变试验评价葛根素的抗诱变性

背景与目的:用TK6人类淋巴母细胞TK基因突变试验评价葛根素的抗诱变性。材料与方法:设溶剂对照组、5μg/ml甲基磺酸甲酯(MMS)组、5μg/mlMMS分别加葛根素25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的各试验组、5μg/mlMMS+100μg/mlVitC对照组,共6组。按上述分组加入葛根素与MMS处理4h后测定第0d的平板接种效率(PE0)、第3d的平板接种效率(PE3)、细胞悬浮生长率(RSG)和总突变频率(TMF)。结果:100μg/ml葛根素剂量组能显著降低MMS诱导的TK基因突变频率。结论:在本实验条件下,葛根素在较高剂量范围可抑制MMS诱导的TK6细胞TK基因突变,有潜在的开发应用前景。

XRCC1参与修复鼠尾草酚诱导的DNA损伤

目的研究鼠尾草酚(carnosol,CAR)诱导的DNA损伤修复机制。方法采用CCK-8试验检测CAR对TK6细胞(人类淋巴母细胞)增殖的影响;利用染色体畸变试验和免疫荧光分析试验分析CAR对TK6细胞的损伤作用和修复机制;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果CAR对TK6细胞呈剂量依赖性抑制,且与野生型(wide type,WT)细胞相比,敲除XRCC1基因的细胞(XRCC1^(-/-))对CAR呈现出敏感性;20μmol·L^(-1)CAR连续处理TK6细胞24 h后,XRCC1^(-/-)细胞比WT细胞的染色体断裂更多;40μmol·L^(-1)CAR连续处理TK6细胞6 h后,XRCC1^(-/-)细胞比WT细胞产生更多的γ-H2AX foci;40μmol·L^(-1)CAR连续处理TK6细胞24 h后,XRCC1^(-/-)细胞比WT细胞凋亡程度增加。结论CAR可以诱导XRCC1^(-/-)细胞比WT TK6细胞产生更多的DNA损伤。因此,XRCC1参与了细胞中CAR造成的DNA损伤的修复反应。

用TK基因突变试验评价大蒜素的抗诱变性

[目的]用TK6人类淋巴母细胞的TK基因突变试验评价大蒜素的抗诱变性,为大蒜素抗诱变作用及其可能机制的研究提供毒理学依据,并为TK基因突变试验在抗诱变性检测方面的应用及推广积累资料。[方法]设溶剂对照组、5μg/ml MMS组、5μg/ml MMS+大蒜素0.1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml试验组、5μg/ml MMS+100μg/ml VitC对照组。分别采用同时处理和后处理两种方法测定PE0、PE3、RS和TFT。[结果]大蒜素在两种处理条件下均能显著降低MMS诱导的TK基因突变频率,并呈较好的量效关系,两种处理条件的作用强度差异无统计学意义。[结论]在本实验条件下,大蒜素可抑制MMS诱导的TK6细胞TK基因突变,有很好的开发应用前景。

用TK基因和HGPRT基因突变试验检测人参皂甙Rg1的抗诱变性

[目的]用TK基因和HGPRT基因突变试验评价人参皂甙Rg1的抗诱变性,为其进一步的开发利用提供资料。[方法]用人参皂甙Rg10.391、3.125、25、200μg/ml与阳性致突变物甲基磺酸甲酯(MMS)5μg/ml同时处理TK6细胞4h,采用微孔板法检测tk和hgprt两个位点突变频率。[结果]随受试物剂量的增加,人参皂甙Rg1拮抗MMS诱变性的作用增大,表现在tk和hgprt两个位点突变频率均较MMS组降低,差异有统计学意义(P﹤0.05)。[结论]人参皂甙Rg1具有拮抗MMS诱导的tk基因和hgprt基因突变的作用;TK6细胞可用于TK基因和HGPRT基因突变的同时检测,但TK基因突变试验比HGPRT基因突变试验更为敏感。

用TK基因和HGPRT基因突变试验检测人参皂甙Re的抗诱变性

背景与目的:用TK基因和HGPRT基因突变试验评价人参皂甙Re的抗诱变性,为其进一步的开发利用提供资料。材料与方法:设人参皂甙Re12.5、25、50、100μg/ml分别与致突变物甲基磺酸甲酯(MMS)5μg/ml同时处理TK6细胞的实验组,同时设溶剂对照组(1DMSO),阳性诱变对照组(MMS5μg/ml)和抗诱变阳性对照组(VitC+MMS),各组处理TK细胞4h后,采用微孔板法检测TK和HGPRT两个位点的突变频率。结果:随着剂量的增加,人参皂甙Re拮抗MMS诱变性的作用增大,表现在TK和HGPRT两个位点突变频率均较阳性诱变对照组降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:人参皂甙Re具有拮抗MMS诱导的TK基因和HGPRT基因突变的作用;TK基因突变试验比HGPRT基因突变试验更为敏感。

基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法的建立

目的:建立基于流式细胞术的生物标记物γ-H2AX自动化检测方法,并探讨此方法用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的前景。方法:试验分为不添加体外代谢活化系统(-S9)长时(24 h)处理组和添加体外代谢活化系统(+S9)短时(4 h)处理组,分别采用CCK-8方法选择4个不同浓度的依托泊苷(ETO)和环磷酰胺(CP)处理人成淋巴TK6细胞,24 h后收获细胞,采用连接荧光分子的γ-H2AX抗体和核酸染料SYTOX Green双色标记,使用高通量流式细胞仪分析组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)阳性的细胞比例。结果:与溶剂对照组比较,-S9 24 h处理组,不同浓度的依托泊苷诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例显著增加,量效关系明显(r=0.999,P<0.05);+S9 4 h处理组,不同浓度的环磷酰胺诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例亦显著增加,量效关系明显(r=0.988,P<0.05)。结论:流式细胞仪可快速、准确地分析体外培养的TK6细胞中γ-H2AX的变化,本试验初步建立了基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法。

氢醌诱导TK6细胞miR-221表达异常致PARP-1基因下调的机制

目的探讨氢醌(HQ)致TK6细胞PARP-1基因表达下调的机制。方法以磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0和10.0μmol/L HQ染毒TK6细胞为染毒组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测miR-221的表达改变,以蛋白印迹法检测PARP-1蛋白表达量,以生物信息学方法分析miR-221的潜在甲基化相关靶基因。结果与对照组相比,2.5、5.0和10.0μmol/L HQ组细胞PARP-1蛋白量逐渐下降,5.0和10.0μmol/L HQ组miR-221表达量分别下降17%(P<0.05)、42%(P<0.05)。miR-221能与MBD2 mRNA的3’非翻译区(UTR)形成调控复合体。结论 HQ致PARP-1基因下调机制可能与miR-221表达异常有关。

低剂量氢醌对TK6淋巴母细胞生物学性状及miR-221表达影响

目的探讨低剂量氢醌(HQ)对TK6淋巴母细胞的生物学性状及小分子非编码RNA(microRNA)-221(miR-221)表达的影响。方法磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0和10.0μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组。应用CCK-8试剂盒检测细胞活力和细胞增殖,通过磷脂结合蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(PI)标记的流式细胞技术检测细胞凋亡,用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-221的表达改变。结果细胞增殖以48 h最为明显,2.5、5.0和10.0μmol/L组细胞增殖指数分别为1.33(P<0.05)、1.14(P<0.05)和1.12(P<0.05);miR-221表达改变以72 h最为明显,2.5、5.0、10.0μmol/L HQ组细胞miR-221表达量分别抑制了0.31倍(P<0.05)、0.39倍(P<0.05)和0.33倍(P<0.05)。结论低剂量HQ能抑制TK6细胞凋亡和miR-221的表达,促进细胞增殖。

氢醌对TK6细胞周期的影响及其相关的调控机制探讨

[目的]探讨氢醌(hydroquinone,HQ)对细胞周期的影响及其相关的调控机制。[方法]磷酸盐缓冲液(PBS)处理人类淋巴母细胞(TK6细胞)为对照组,20.0μmol/L HQ为处理组,48 h后通过碘化丙啶(PI)标记的流式细胞术检测细胞周期分布情况,用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PTEN(抑癌基因)、p53基因mRNA表达的改变,流式细胞荧光标记法检测Rb蛋白的表达。[结果]与对照组比较,处理组G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05);HQ作用于TK6细胞后上调了Rb的表达,下调了p53的表达,其差异均有统计学意义(P<0.05),而对PTEN的表达没有明显影响。[结论]HQ可能通过上调Rb的表达使细胞阻滞于G1期。

白血病相关原癌基因在氢醌处理TK6细胞中的表达

目的探索氢醌(hydroquinone,HQ)致DNA整体低甲基化的后续结果。方法用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,以PBS处理组为对照组,分别以2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L HQ染毒TK6细胞为处理组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测白血病相关原癌基因MPL、BRAF、ERBB2、MYB、MYC和RAF1的表达水平。结果与对照细胞相比,HQ处理细胞MPL和RAF1的mRNA表达量都随HQ剂量增加而上升,其中20μmol/L HQ对原癌基因表达的影响最为明显,分别上升了80%(P<0.05)和35%(P<0.05);MYB、MYC和ERBB2基因的mRNA表达量随HQ的剂量上升而下降。结论 MPL的转录活化很有可能与HQ导致的DNA整体低甲基化有关。