鸡Ⅰ型IFN及TLR-3和TLR-7实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为检测鸡抗病毒相关基因在病毒感染过程中的动态变化规律,研究建立了鸡IFN-a、IFN-β、TLR-3和TLR-7的实时荧光定量RT-PCR的检测方法。根据GenBank提供的鸡IFN-α、IFN-β、FLR-3和TLR-7参考序列设计了相应的特异引物,用常规RT-PCR方法从鸡脾脏总RNA中扩增得到鸡相应基因。将其cDNA分别克隆到pMD19-T载体中进行测序鉴定,采用SYBR Green I染料法,建立标准曲线并分析其溶解曲线。结果表明,这4种基因的检测灵敏度可高达46 copies/μL,且具有良好的特异性和重复性。此检测方法的建立为动态定量检测及研究鸡IFN-α、IFN-β、TLR-3和TLR-7基因的表达变化提供了有效的手段。

芪苈强心胶囊联合沙库巴曲缬沙坦钠对老年慢性心力衰竭患者血清Gal-3、Copeptin水平及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨芪苈强心胶囊辅助治疗老年CHF对患者Gal-3、Copeptin水平及TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法:采用随机数表法将2021年3月至2023年3月平顶山市第一人民医院112例老年CHF患者分为采用沙库巴曲缬沙坦钠(诺欣妥)治疗的常规组(n=56例)和采用芪苈强心胶囊辅助治疗的联合组(n=56例)。观察两组疗效、心功能、血清半乳糖凝集素-3(Gal-3)、Copeptin水平、Toll样受体(TLR4)、核因子-κ(NF-κB)水平及不良反应。结果:治疗3个月后,联合组的临床治疗总有效率、心输出量(CO)、左心室射血分数(LVEF)高于常规组(P<0.05);联合组TLR4、NF-κB、Gal-3、Copeptin水平低于常规组(P<0.05);两组患者用药期间不良反应发生率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:芪苈强心胶囊联合沙库巴曲缬沙坦钠可调节TLR4、NF-κB水平,促进老年CHF患者心功能恢复,并抑制心肌重构,进而有效提高临床治疗疗效,且不增加患者不良反应发生风险。

TLR-3在骨骼肌萎缩中的作用

[目的]禁食、慢性疾病等会导致肌肉萎缩的发生,临床表现为肌肉质量下降、肌纤维直径变小、肌肉张力以及抗疲劳能力下降等。有研究显示,小鼠成肌细胞C2C12中7种Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)均表达,为了进一步研究TLR家族中TLR-3在肌萎缩中的作用机制,探讨治疗肌萎缩的新方法。[方法]以小鼠C2C12细胞为实验材料,地塞米松处理构建肌肉萎缩模型,转染si TLR-3后通过免疫荧光、q PCR和Western Blot方法检测对肌细胞萎缩模型的改善情况。[结果]发现干涉TLR-3能明显改善细胞萎缩模型的表型,并使肌萎缩标志性基因MuRF和MAFbx在mRNA水平和蛋白水平均明显下调。[结论]以上结果说明干涉TLR-3改善了成肌细胞肌萎缩症状,该研究为探明Toll样受体家族在肌萎缩中的作用机制,及肌肉疾病的防治奠定基础。

牦牛TLR-4基因3′-UTR区扩增克隆及相关miRNAs生物信息学分析

本试验采用构建DNA混池和测序的方法,对西藏、青海341头牦牛TLR-4基因3′-UTR区单核苷酸多态性(SNP)位点进行筛选,然后用DNAMAN 8.0软件进行序列对比分析,并通过TargetScan 7数据库预测牦牛TLR-4基因3′-UTR区的微小RNAs(miRNAs)的可能靶定。结果显示,牦牛TLR-4基因3′-UTR区可能存在2个SNP位点,分别为A^(380)G和A^(382)G,通过TargetScan7数据库在线预测到牦牛TLR-4基因3′-UTR区共18个miRNAs可能靶定。本试验为牦牛TLR-4基因3′-UTR区可能存在的A^(380)G和A^(382)G突变位点与所预测的miRNAs之间靶向验证提供了初步理论根据,提示可通过分子水平进行抗病育种提高牦牛群体免疫力。

基于TLR3/NF-κB信号通路探讨RSV诱导COPD急性加重的分子机制

目的基于Toll样受体(TLR)3/核转录因子(NF)-κB信号通路探讨呼吸道合胞病毒(RSV)诱导慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重的分子机制。方法将SD大鼠分为3组,每组6只。正常组和COPD组用烟熏法建立COPD大鼠模型后,用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g体质量经腹腔注射麻醉,每一个鼻孔内滴入0.4μl/g的无病毒培养基;RSV+COPD组用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g体质量经腹腔注射麻醉,在每一个鼻孔内滴入0.4μl/g滴度为5×104TCID50/0.1 ml的RSV悬液。以上操作每周重复1次。第8周取肺组织苏木素-伊红(HE)染色观察病理改变;免疫组织化染色检测TLR3在肺组织中的表达,Western印迹检测TLR3、NF-κB p65在肺组织中的蛋白表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-6和IL-32蛋白水平。结果RSV+COPD组体质量增长比COPD组明显减慢(P<0.05),肺部病理学切片提示炎症明显加重。RSV+COPD组肺组织TLR3的免疫阳性信号较COPD组显著增高,RSV+COPD组肺组织中TLR3、NF-κB p65、IL-6及IL-32蛋白表达较COPD组显著增高(P<0.05)。结论RSV诱发COPD急性加重的机制可能是通过上调TLR3并激活NF-κB信号通路。

黄连解毒汤含药血清对Toll样受体34、型及其下游信号转导通路的影响

目的:研究黄连解毒汤含药血清对细菌脂多糖和双链RNA病毒核酸类似物聚肌胞刺激的小鼠巨噬细胞株RAW264.7 Toll样受体(TLR)及其下游主要信号转导通路的影响。方法:用脂多糖、聚肌胞分别刺激RAW264.7细胞,同时给予黄连解毒汤含药血清进行干预,24 h后,取细胞培养上清液,ELISA法测定炎症因子TNF-α和IFN-β的含量,荧光定量PCR方法测定TLR3、TLR4和下游信号转导通路髓样分化因子88(MyD88),肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6),TOLL样受体相关分子(TRAM)和TOLL样受体相关的干扰素活化子(TRIF)mRNA的表达,Western blotting法分析TLR3、TLR4蛋白的表达,同时用细胞免疫荧光法分析MyD88,TRAF-6蛋白表达的强弱,在mRNA水平和蛋白水平探讨黄连解毒汤对Toll样受体的作用机理。结果:黄连解毒汤含药血清显著降低LPS诱导的TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM和TRlF的高表达(与单纯LPS刺激组比较,P<0.05或P<0.01);Poly(I:C)刺激后,黄连解毒汤含药血清仅对TRAM利TRIF的表达有明显的降低作用(P<0.01)。结论:黄连解毒汤能阻断TLR4高表达,阻断TLR4胞内信号转导的MyD88依赖和非依赖两条途径(以阻断非依赖途径为主),抑制相关基因表达产物TNF-α、IFN-β过度分泌,具有TLR4拮抗剂样作用。黄连解毒汤也可直接作用于接头蛋白TRAM和TRIF,影响TLR3信号转录的MyD88非依赖性途径,抑制IFN-β的过度分泌。

聚肌苷酸-聚胞苷酸对人髓核细胞基质金属蛋白酶-1、13表达的影响

目的探究聚肌苷酸-聚胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid,Poly(I:C)]对人髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)-1、13表达的影响。方法取人椎间盘组织,采用酶消化法分离并体外培养NPC。不同时间不同剂量的Poly(I:C)刺激NPC,利用qPCR和Western blot方法检测MMP-1、13的mRNA和蛋白质表达情况;siRNA分别沉默TLR-3、RIG-1和MDA-5后,Poly(I:C)刺激NPC,qPCR检测MMP-1、13的mRNA表达情况。结果分离培养的NPC 5~6d后,贴壁生长;Poly(I:C)刺激NPC后,MMP-1、13的mRNA和蛋白质表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);siRNA沉默TLR-3后,MMP-1、13的mRNA表达水平受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.05);siRNA沉默RIG-1和MDA-5后,MMP-1、13的mRNA表达水平不受影响(P>0.05)。结论Poly(I:C)通过TLR-3受体途径促进NPC表达MMP-1、13。

绿原酸通过调节TLR3-TRIF通路抑制小胶质细胞炎性反应的机制研究

目的:研究绿原酸(chlorogenic acid,CGA)在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染的BV2小胶质细胞中的抗炎作用。方法:把不同浓度梯度的CGA加入到正常BV2细胞中,通过CCK-8试剂盒测定CGA最大无毒浓度范围,以HSV-1感染BV2细胞建立HSV-1细胞模型,然后用不同浓度梯度的CGA进行处理,通过Real-time PCR检测Toll样受体(toll-like receptor 3,TLR3)信号通路中β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIRdomain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)mRNA的表达,Western blot检测TLR3、TRIF的蛋白表达情况,ELISA检测炎性因子组织细胞内干扰素α(interferon-α,IFN-α)水平。结果:单纯疱疹病毒性脑炎细胞模型中TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α水平均明显高于正常对照组(P<0.05);而绿原酸干预可有效抑制炎性反应,TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α水平均明显降低。结论:绿原酸能明显抑制小胶质细胞内TLR3通路,降低HSV-1引起的炎性反应。

TLR与PI3K-Akt通路交互调控的研究进展

Toll样受体(Toll Like Receptor,TLR)作为模式识别受体,对机体的免疫防御和稳态维持至关重要。为了保证TLR通路介导的免疫反应适时适度地进行,机体存在对TLR通路的精细的正负调控机制。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase,PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路在细胞的增殖、分化、迁移和代谢等众多生理过程中都发挥重要调控作用,也参与了TLR通路的负调控。TLR通路和PI3K-Akt通路之间存在复杂的交互调控,但细节部分一直未被充分阐明。本文对这一领域的相关文献进行综述,以期增进对TLR通路调控机制的理解。

Poly(I:C)刺激下猪肺泡巨噬细胞TLR3基因及其信号通路基因表达变化分析

为了探讨猪肺泡巨噬细胞(3D4/21细胞)在聚肌胞苷酸Poly(I:C)刺激下发生的免疫应答分子机制,通过Poly(I:C)模拟病毒体外刺激3D4/21细胞,分别于不同处理时间(4、8、12、24 h)观察细胞形态变化,并采用qPCR方法检测Toll受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)基因及其信号通路相关基因的表达量变化。结果表明,Poly(I:C)能够刺激3D4/21细胞诱导TLR3信号通路相关基因表达量发生变化。试验组 TLR 3 基因和干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)基因的表达量在4个处理时间均表现为先下调后上调的趋势,两者均在处理24 h时表达量最高,其表达量分别是对照组的2.77倍和1.42倍, TLR 3 基因在12 h和24 h与对照组相比差异显著( P < 0.05 ), IRF 3 基因在4个处理时间与对照相比均差异不显著;试验组干扰素α(Interferon α,IFNα)基因在4个处理时间中呈现上调趋势,在24 h时表达量最高,其表达量是对照组的2.91倍,且差异显著( P <0.05);试验组共刺激分子 CD 86 基因的表达量呈现先上升后下降的趋势,于12 h时表达量最高,表达量是对照组的17.60倍,且差异极显著( P <0.01)。因此,猪体内 TLR 3 基因及其信号通路相关基因参与了Poly(I:C)刺激并引起症状的过程,表明 TLR 3 基因及其信号通路相关基因的表达水平对猪病毒性疾病存在一定调控作用。

血清pro-ADM、Galectin-3联合TLR-4对未足月胎膜早破孕妇亚临床绒毛膜羊膜炎的预测价值

目的:分析血清肾上腺髓质素前体(pro-ADM)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)联合Toll样受体4(TLR-4)对未足月胎膜早破(PPROM)孕妇亚临床绒毛膜羊膜炎(HCA)的预测价值。方法:研究纳入徐州医科大学附属医院及新疆伊犁哈萨克自治州友谊医院产科2021年6月1日-2023年6月1日收治PPROM孕妇160例为研究对象,按照PPROM孕妇产后胎盘病理结果划分为HCA组(n=71)与非HCA组(n=89),使用酶联免疫吸附法检测孕妇血清pro-ADM、Galectin-3、TLR-4水平,采用单因素与多因素Logistic分析组间发生HCA的相关因素,作受试者工作特征曲线(ROC)曲线分析模型预测价值。结果:单因素分析结果显示:HCA组经产妇、剖宫产比例高于非HCA组,血清PCT、CRP、pro-ADM、Galectin-3、TLR-4水平高于非HCA组(P<0.05);经过Logistic回归分析发现,PCT、CRP、pro-ADM、Galectin-3、TLR-4是PPROM孕妇HCA发生的独立危险因素(P<0.05);建立PPROM孕妇HCA影响因素之诊断效能的ROC分析模型,pro-ADM、Galectin-3、TLR-4三项指标独立及联合预测时曲线下面积(AUC)分别为0.720、0.743、0.790、0.874,显见联合应用诊断效能更高。结论:血清pro-ADM、Galectin-3、TLR-4水平升高提示PPROM孕妇HCA发生风险升高,三项联合对PPROM孕妇HCA疾病中预测价值较高。

NLRP3炎症小体与相关炎症信号通路在肾缺血-再灌注损伤中的作用

肾缺血-再灌注损伤(IRI)常见于肾移植术中,是引起急性肾衰竭的重要病理生理过程,严重影响受者预后。炎症反应在IRI的发病机制及病理过程中占据着重要地位。活化的NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体可通过介导多种促炎因子的成熟与释放,调节机体炎症反应及相关细胞功能。本文对肾IRI中的NLRP3炎症小体及其相关炎症信号通路的作用机制进行了总结,旨在为临床肾IRI的防治提供新思路。

MicroRNA调控固有免疫应答的分子机制

MicroRNA(miRNA)是近几年继siRNA之后非编码RNA研究的又一热点.它通过与靶mRNA的特异性结合,在转录后水平上对基因表达进行调控.研究表明,miRNA可能参与脊椎动物固有免疫应答的多个环节.在病原微生物感染时,它们不仅成为重要的固有免疫受体活化后的信号调节分子,而且能够直接干扰病毒复制而发挥抗病毒效应.miRNA可能与经典的固有免疫应答体系共同组成机体抵御病原微生物入侵的"第一道防线".同时,病原微生物,特别是病毒还可以通过自己编码miRNA或者改变宿主细胞miRNA表达谱直接或间接地干扰很多宿主免疫相关基因的表达,实现逃逸机体免疫清除的目的.因此,miRNA水平的相互作用可能是病原微生物与其宿主展开免疫"博弈"的重要战场.

右美沙芬对神经胶质瘤U87细胞的抑制作用及其机制研究

目的探讨右美沙芬(dextromethorphan,DM)对胶质瘤U87细胞的抑制作用及其潜在机制。方法将神经胶质瘤U87细胞分别设为正常对照组及不同浓度DM实验组,利用CCK-8检测不同浓度DM对U87细胞活性的影响。Western blot检测DM处理48h后U87细胞中热休克蛋白60(HSP60)、热休克转录因子1(HSF-1)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、核因子-κB(NF-κB)和Toll样受体4(TLR-4)的表达水平。免疫荧光化学染色法检测DM处理48h后U87细胞的形态及数目变化。结果CCK-8细胞增殖实验检测结果表明,与对照组相比,10μM的DM处理U87细胞48 h后,细胞活力差异无统计学意义(P>0.05),而25~100μM的DM处理U87细胞后,细胞活力均降低(P<0.05或<0.01),与对照组比较,25μM的DM处理U87细胞48后HSP60、HSF-1和Caspase-3的表达升高,NF-κB和TLR-4表达均降低(P均<0.05)。结论DM对U87细胞活性具有抑制作用,但不是通过HSP60上调TLR-4/NF-κB信号通路进而促进U87细胞发生凋亡实现的,其机制有待进一步研究。

溪黄草水提物对高糖诱导的大鼠HBZY-1细胞炎症反应和氧化应激的抑制作用以及对TLR 4/NF-κB/NLRP 3通路的作用

目的:溪黄草水提物(RWE)对高糖诱导的大鼠HBZY-1细胞炎症反应和氧化应激的抑制作用以及对TLR 4/NF-κB/NLRP 3通路的作用。方法:用高糖(HG,30 mmol·L^-1)孵育大鼠肾小球细胞株HBZY-1细胞,MTT法测定不同浓度RWE(5,10,20 mg·mL^-1)对HG环境下HBZY-1细胞增殖的影响,测定RWE对HG诱导的HBZY-1细胞氧化应激水平和炎性细胞因子表达的影响,同时测定其对细胞TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的影响。结果:HG能诱导HBZY-1细胞增殖,提高MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平和TLR 4/NF-κB/NLRP 3信号通路的表达,降低SOD和GSH水平;RWE减弱细胞的增殖能力,降低MDA、IL-6、IL-1β和TNF-α的水平,提高SOD和GSH水平,抑制TLR 4/NF-κB/NLRP 3信号通路的表达。结论:RWE对HG诱导的HBZY-1细胞具有保护作用,其作用机制主要是抑制炎症反应和氧化应激,TLR 4/NF-κB/NLRP 3信号通路可能参与RWE对细胞的保护作用。