斑点叉尾鮰TLR5和TLR5S基因在不同病原诱导下的表达特征

分别用迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、链球菌Streptococcus iniae和斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(channel catfish hemorrhage reovirus,CCRV)对斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus进行感染实验,取感染后0h、12h、24h、48h、72h和7d的头肾、肠、肝脏和脾脏,采用实时定量PCR方法检测了TLR5和TLR5S基因在这4种免疫相关组织中的时空表达特征,探讨它们与斑点叉尾鮰先天免疫反应的关系。结果表明,链球菌和迟钝爱德华氏菌能够引起TLR5和TLR5S强烈的上调表达,其中以感染链球菌12h后TLR5S在头肾中的表达上调量最为显著,与对照组相比提高了132倍(P<0.01)。在感染嗜水气单胞菌后的24h内TLR5和TLR5S基因的表达量上升,但随后却显示出了明显的下调趋势,而斑点叉尾鮰呼肠孤病毒在TLR5和TLR5S基因表达中起到了明显的抑制作用,于大部分组织中表达下调。在感染12h的脾脏中,TLR5基因的表达量仅为对照组的0.017倍(P<0.01),而TLR5S基因表达量达到最低,仅为对照组的0.01倍(P<0.01)。从不同的组织来看,TLR5在肠中的表达上调幅度最大,而TLR5S在头肾中的表达增幅最明显,如感染链球菌和迟钝爱德华氏菌12h后,TLR5在肠中的表达量分别增加了50.4倍(P<0.01)和14.8倍(P<0.01),TLR5S在头肾中的表达量分别上升了52.8倍(P<0.01)和132倍(P<0.01)。以上结果进一步证明了TLR5和TLR5S基因在斑点叉尾鮰先天免疫反应过程中发挥着非常重要的作用,同时在抗病原侵袭过程中表现出了一定的组织特异性和病原特异性。

TLR5基因多态性与非贲门胃癌的关联研究

目的探讨TLR5基因单核苷酸多态性与非贲门胃癌发病风险的关系,为非贲门胃癌的早期诊断和治疗提供理论基础和实验依据。方法用病例对照关联研究的方法,在包头地区汉族人群中收集了288例经组织病理学诊断为非贲门胃癌的患者和281例正常对照。用Taq Man法对TLR5基因SNP rs34270714、rs5744174、rs851139、rs17163737进行基因分型;Haploview 4.0软件被用来构建单体型,同时运用非条件性Logistic回归计算比值比(OR)及其95%可信区间(CI),评估各等位基因、基因型及单体型与非贲门胃癌发病风险的关系。结果包头地区汉族人群中TLR5基因SNP rs17163737与非贲门胃癌的发病风险相关联,与携带GG基因型的人群比较,GT基因型携带者非贲门胃癌的发病风险提高1.605倍(GT vs GG:OR=1.605,95%CI=1.131~2.280),其余SNP与非贲门胃癌的发病风险无关联(P>0.05)。同时,单体型分析结果显示:rs5744174-rs851139-rs17163737存在强连锁不平衡,构成单体型区域(Block);然而各单体型均与非贲门胃癌发病风险无关联。结论包头汉族人群中TLR5基因SNP rs17163737 GT基因型携带者非贲门胃癌的发病风险增高。

基于TLR5-NF-κB通路筛选四物汤中的活性成分

目的基于TLR5-NF-κB通路建立报告基因系统筛选四物汤中的有效成分。方法利用脂质体转染试剂Li-pofectin 2000将含有hTLR5基因和NF-κB Luc报告基因的质粒转染入人胚肾细胞(HEK293细胞),加入药物刺激后再检测细胞荧光素酶表达水平,筛选出能够激活TLR5受体及其下游NF-κB通路的有效成分。结果果糖、腺嘌呤能够显著激活此通路,且随果糖、腺嘌呤作用浓度的增加对细胞膜表面TLR5受体及其下游的NF-κB通路激活作用也随之增强,叶酸、东莨菪内酯、芍药苷、盐酸川芎嗪、β-谷甾醇、阿魏酸也能一定程度激活此通路。结论通过TLR5受体介导NF-κB通路激活剂筛选模型,筛选出四物汤内果糖、腺嘌呤、芍药苷、盐酸川芎嗪、叶酸、东莨菪内酯、β-谷甾醇、阿魏酸8种单体在一定浓度范围内能够激活TLR5受体及其下游的NF-κB通路。

半滑舌鳎TLR5S三种剪切型基因的克隆与表达分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)是TLRs家族成员之一,可分为跨膜型TLR5M和鱼类特有的可溶型TLR5S,它们可以识别致病菌表面的鞭毛蛋白并协同作用激活免疫反应。为了研究半滑舌鳎受到病原感染后TLR5S参与免疫反应的作用,本研究使用RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)TLR5S全长c DNA序列。TLR5S c DNA有3种剪切型:Cs.TLR5S x1,Cs.TLR5S x2和Cs.TLR5S x3。这3种剪切型的相同区域为308 bp 5′非编码区(5′UTR)和1701 bp开放阅读框(ORF),不同的3′UTR分别为138 bp、364 bp和637 bp。Cs.TLR5S共编码567个氨基酸,预测编码蛋白质分子量为64.03 k D,等电点为8.49。氨基酸多重序列比对结果显示,Cs.TLR5S氨基酸序列与其他脊椎动物TLR5S氨基酸序列具有较高的相似性,其中与牙鲆相似度高达61%,表明Cs.TLR5S在进化上的具有一定的保守性。Real-time PCR结果表明该基因在半滑舌鳎的不同组织均有表达,其中在肝的表达量最高,在脾的表达量最低。此外,检测Cs.TLR5S 3′端的不同剪切型在肝、脾、头肾、小肠中的表达,结果显示Cs.TLR5S x3只在肝中高表达,而Cs.TLR5S x1则在肝和小肠中都有中等程度表达。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎实验表明,注射菌液6 h后,Cs.TLR5S基因在肾、小肠、肝和脾4个组织中的表达量都有显著上升;注射鳗弧菌48 h后,以上4种组织中表达量均呈现降低的变化。上述实验结果说明,Cs.TLR5S基因可能参与了半滑舌鳎抗弧菌感染的免疫反应。

TLR5基因启动子区甲基化修饰与苏太断奶仔猪E. coli F18抗性的关系

旨在分析探讨TLR5基因启动子区甲基化修饰对断奶仔猪F18大肠杆菌抗性的调控作用。本研究首先利用qPCR和Western blot检测分析了TLR5基因在F18大肠杆菌抗性型和敏感型苏太断奶仔猪小肠组织(十二指肠和空肠)中的差异表达,然后利用生物信息学分析和双荧光素酶报告系统检测确定TLR5基因核心启动子区、CpG岛及其作用元件,进而检测并分析TLR5基因启动子区甲基化修饰与TLR5基因在F18大肠杆菌抗型和敏感型断奶仔猪小肠组织中表达水平的相关性。结果表明,TLR5基因在敏感型断奶仔猪十二指肠和空肠组织中的mRNA表达水平分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)高于在抗性型个体中的表达,且十二指肠和空肠组织中敏感组蛋白表达水平均显著高于抗性组(P<0.05)。TLR5基因启动子区包含2个CpG岛和16个作用元件,启动子区第2个CpG岛第6个CG位点甲基化水平对TLR5基因的表达具有一定的调控作用,该位点位于转录因子Sp1结合的核心启动子区域。本研究结果表明,猪TLR5基因的表达水平和F18大肠杆菌的抗性有关,其低表达可能有利于F18大肠杆菌抗性;TLR5基因启动子区第2个CpG岛第6个CG位点甲基化能够显著抑制TLR5基因的表达,并最终影响断奶仔猪对大肠杆菌的抗性。

CRISPR/Cas9介导TLR5敲除猪肺泡巨噬细胞系建立及对革兰阴性菌黏附能力的影响

Toll样受体5 (TLR5)是Toll-like受体家族中的重要成员,在革兰阴性菌引起的炎症反应中发挥着重要的调控作用。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对猪肺泡巨噬细胞(PAMS)的TLR5基因进行敲除,然后经菌落计数,检测TLR5基因敲除后对大肠埃希菌F18ab和F18ac以及沙门菌黏附能力的影响。结果表明:设计的2条sgRNAs成功插入CRISPR/Cas9载体中,序列正确,转染猪肺泡巨噬细胞后均能稳定表达,且PCR测序峰图出现套峰,表明敲除载体具有切割活性。利用有限稀释法,最终获得1株缺失15个碱基的单克隆细胞系TLR5-sg1。对TLR5敲除细胞进行qPCR和Western blot验证,结果显示TLR5基因的转录水平极显著下调,其蛋白质水平也明显降低。细菌黏附试验结果显示,TLR5敲除细胞中黏附的大肠埃希菌F18ab、F18ac和沙门菌(ATCC13312)的数量均极显著低于对照组。这一研究成功建立了猪TLR5基因敲除的3D4/21细胞系,且TLR5基因的敲除会降低大肠埃希菌和沙门菌对3D4/21细胞的黏附能力,为进一步探究TLR5基因的生物学功能建立了细胞模型,为深入探讨TLR5基因在炎症反应中的免疫调控作用提供了试验素材。

TLR5 rs2072493与幽门螺杆菌感染的关系研究

目的探讨Toll样受体5(TLR5)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)rs2072493位点与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染的关系。方法选取包头地区健康体检者683名的血液样本,采用酶联免疫吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)检测所有样本中H.pylori的感染情况,根据抗体滴度将样本分为H.pylori阴性组(n=305)和H.pylori阳性组(n=378),采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)对TLR5 rs2072493位点进行基因分型,采用非条件性Logistic回归分析在共显性、显性、隐性三种遗传模式下rs2072493与H.pylori感染的关系。结果在共显性遗传模式下,TLR5基因SNP rs2072493与H.pylori的感染关联,与AA基因型携带者相比,携带AG基因型者可使H.pylori感染的风险降低(OR=0.576,95%CI:0.358~0.927)。结论TLR5 rs2072493携带AG基因型者H.pylori感染风险降低。

牦牛Toll样受体5基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布牛Toll样受体5(toll-like receptors 5,TLR5)基因序列,设计全长引物,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析结果表明,克隆得到牦牛TLR5基因全长2582bp,开放阅读框2577bp,编码氨基酸858个,N端含有21个氨基酸组成的信号肽,分子质量为97.981ku,理论等电点为4.85;蛋白预测结果表明,TLR5编码蛋白整体表现为亲水性;同源性分析结果表明,牦牛与野牦牛、黄牛、绵羊、山羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,说明TLR5基因序列具有较高的保守性。牦牛TLR5基因序列的成功克隆为今后深入研究牦牛及高原动物抗病及免疫机制提供非常重要的理论基础。

绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因的克隆和适应性进化分析

【目的】获得绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因(TLR5)编码区序列,并对其编码区蛋白的特征及适应性进化进行分析。【方法】以绿尾虹雉基因组DNA为模板,采用PCR扩增克隆获得TLR5基因编码区序列。使用MEGA、PAML等软件对其序列特征及选择压力进行分析。【结果】绿尾虹雉TLR5基因编码区序列全长2 583 bp,共编码860个氨基酸,以亮氨酸含量最高(133/860),色氨酸含量最低(11/860)。编码蛋白为典型的Ⅰ型跨膜结构,包括富含LRRs结构域的胞外区、跨膜区和胞内TIR结构域。绿尾虹雉TLR5基因极其保守,与雉鸡(P. colchicus)的同源性最高(97.75%),与小白鹭(E. garzetta)同源性最低(85.17%)。采用位点-特异模型在胞外区共检测到3个正选择氨基酸位点(263F, 280K和645I)。【结论】绿尾虹雉TLR5基因编码区受到较强的纯净化压力,胞外区LRRs结构域可能为识别病原微生物的区域。

中国荷斯坦牛与务川黑牛TLR_(5)基因SNPs及序列特征分析

为了筛查牛Toll样受体家族(toll-like receptors,TLRs)基因TLR_(5)的单核苷酸多态性(SNPs)位点,试验采用DNA混合池扩增后直接测序的方法对中国荷斯坦牛和务川黑牛8个外显子SNPs位点进行检测,并估算SNPs位点的等位基因频率,同时利用生物信息学分析方法对TLR_(5)基因的mRNA二级结构、氨基酸理化性质、编码蛋白质的亲/疏水性、蛋白质二级和三级结构进行预测与分析。结果表明:中国荷斯坦牛和务川黑牛TLR_(5)基因上共有5个SNPs位点,分别为g(N).T^(1850)C、g(N).G^(2549)A、g(W).T^(1850)C、g(W).G^(2297)C、g(W).G^(2549)A,其中g(N).T^(1850)C、g(W).T^(1850)C位点为错义突变,均导致氨基酸由亮氨酸变为丝氨酸,其余为同义突变。TLR_(5)基因错义突变位点g(N).T^(1850)C和g(W).T^(1850)C的mRNA二级结构自由能增加,均为-3593.55 kJ/mol,增加了mRNA二级结构的稳定性;而同义突变位点中仅g(W).G^(2297)C的mRNA二级结构的自由能略减少,为-3574.14 kJ/mol,降低了mRNA二级结构的稳定性。中国荷斯坦牛和务川黑牛TLR_(5)基因均编码909个氨基酸,均表现为编码的丝氨酸占比最多,编码氨基酸的不稳定指数均大于40,平均亲/疏水性分值为0.064分和0.067分,编码的蛋白质是不溶性蛋白质,二级结构中均为无规则卷曲占主导地位,三级结构突变前后均没有发生明显变化。说明TLR_(5)基因的突变可能与奶牛乳房炎相关,其突变位点有可能成为中国荷斯坦牛和务川黑牛乳用性状选育的分子标记。