磷酸三丁酯诱导下海洋浮游植物活性氧产生的分子机制研究

随着多溴联苯醚被逐步禁用,有机磷酸酯成为主要的替代品被广泛使用,逐渐进入到海洋环境中,给海洋生物带来极大威胁。由有机磷酸酯导致的活性氧(ROS)过多积累而产生的氧化损伤被认为是其致毒的主要机制。但在浮游植物细胞中,ROS如何被诱导产生并不清晰。本文以海洋硅藻——三角褐指藻为研究对象,利用转录组和生理生化手段,研究了浮游植物细胞ROS产生与清除过程对一种烷基有机磷酸酯——磷酸三丁酯(TnBP)的响应特征。结果表明,不同浓度TnBP胁迫(1.5、3.0和4.5μmol·L^(-1))能够诱导三角褐指藻细胞内ROS含量上升。转录组和生理生化验证结果显示,TnBP抑制了三角褐指藻的岩藻黄素-叶绿素a/c蛋白复合体捕光天线蛋白和放氧复合体关键组分的基因表达,下调了铁氧还蛋白-NADP+还原酶等电子传递链关键基因的表达量和电子传递速率,促进了ROS的产生。同时,TnBP抑制了过氧化物酶体中与货物蛋白转运相关基因的表达。在谷胱甘肽代谢途径中,TnBP虽然诱导抗坏血酸抗氧化酶活性升高,但降低了谷胱甘肽还原酶活性和基因表达,造成还原型/氧化型谷胱甘肽比值下降,表明TnBP抑制了藻细胞对ROS的清除能力,最终引起了ROS的过量积累。在所有的生理生化指标中,光合电子传递速率可以作为敏感的生物标志物来反映TnBP对浮游植物的生态毒性。研究结果将为包含TnBP在内的烷基有机磷酸酯的毒性作用模式提供依据,对于海洋生态系统中有机磷酸酯的风险评估具有实际意义。

S/D灭活血浆内脂包膜病毒及病毒灭活血浆的研究

研究磷酸三丁酯 (TNBP) /TritonX 10 0对血浆内脂包膜病毒的灭活效果。用VSV病毒和Sindbis病毒作指示病毒 ,加入血浆后再加磷酸三丁酯 /TritonX 10 0 ,观察病毒的滴度变化及对血浆蛋白的影响。结果发现终浓度各为1%的磷酸三丁酯 /TritonX 10 0在 60min内可以灭活血浆内的两种指示病毒 ,而血浆蛋白的组成和功能变化很小。经层折、超滤后血浆内磷酸三丁酯和TritonX 10 0的残余量分别低于 5μg/ml,表明S/D处理血浆的安全性和治疗作用都很好 ,其制剂冰冻血浆或冻干血浆可用于临床治疗凝血因子缺乏症 。

病毒灭活和SD血浆的制备

建立制备病毒灭活SD血浆的方法。血浆内加入 1%TNBP/ 1%TritonX10 0 ,30℃保温 4h后用反相层析和超滤去除血浆中的TNBP和TritonX10 0。在 30℃保温 15min后血浆内脂包膜病毒全部被杀灭。超滤后的血浆内TNBP和TritonX10 0的含量都低于 5mg/L。SD血浆蛋白含量的改变都在准许的范围内。建立了一种病毒灭活血浆的制备方法。

磷酸三正丁酯对蚯蚓的生态毒性效应

有机磷酸酯(OPEs)作为一种新型的阻燃剂和增塑剂,在环境中普遍存在,尤其在土壤中常被检出,因此其环境和健康风险亟待评估。为探究OPEs对土壤生物的毒性效应,选取磷酸三正丁酯(TnBP)作为受试物,以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为指示生物,采用人工土壤法研究不同浓度TnBP对蚯蚓生长、抗氧化酶系统、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性、体腔细胞DNA损伤及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量的影响。结果表明,TnBP暴露对蚯蚓生长无明显抑制作用,但TnBP胁迫可引起蚯蚓体内抗氧化酶活性增强,脂质过氧化产物丙二醛含量显著上升,表明蚯蚓受到氧化损伤;彗星试验结果显示,彗尾DNA含量和Olive尾矩均显著上升,表明TnBP暴露能够引起蚯蚓体腔细胞DNA损伤;8-OHdG含量也显著增加,其水平与暴露浓度存在明显的剂量-效应关系,提示TnBP暴露可引起蚯蚓体腔细胞氧化性DNA损伤;AChE活性受到的影响则较为微弱。综上,本研究阐明了TnBP暴露对蚯蚓的毒性效应并为进一步研究OPEs对土壤的生态风险评估提供科学依据。

冻干人纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量的气相色谱法测定

采用气相色谱法测定冻干人纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量。以磷酸三丙酯 (TPP)作内标 ,采用 HP-2 0 M(Carbowax2 0 M)色谱柱 ,气化室温度 :190°C;检测器温度 :2 10°C;柱温 :140°C;载气为氮气。磷酸三丁酯在 2～16 μg/ml浓度范围内线性关系良好 ,相关系数为 0 .9995 ,平均回收率为 10 0 .2 % (RSD2 .78% )

气相色谱法测定降纤酶中磷酸三丁酯残留量

目的 建立毛细管气相色谱法测定降纤酶原液中磷酸三丁酯残留量。方法 以磷酸三丙酯作内标,采用AT-FFAP色谱柱（30 m×0.32μm×0.25 mm）;气化室温度190℃;检测器温度210℃;柱温140℃;载气为氮气。结果 磷酸三丁酯在质量浓度2～16μg/m L内线性关系良好;r为0.9973;质控样品在低、中、高3个浓度下加样回收率分别为98%、101.3%、100.6%,RSD分别为：1.8%、1.08%、2.51%（n=3）。结论该方法快速、准确,适用于降纤酶原液中磷酸三丁酯残留量的测定。

制备去细胞人体肌腱支架材料的实验研究

目的探索化学萃取法制备去细胞人体肌腱支架材料的实验方法。方法用1．0％磷酸三丁酯[tri（n—butyl）Phosphate，TnBP]分别联合0％、0．25％、0．50％及1．00％曲拉通-100（TritonX-100）对人体肌腱进行去细胞处理，通过组织学、扫描电镜观察、生物力学和羟脯氨酸含量测定，并与新鲜人体肌腱对比，评价去细胞人体肌腱支架材料的特性。结果肌腱去细胞处理后色泽光亮，腱膜完整，韧性好；1．00％TnBP加0％TritonX-100组仍有少量细胞存留，其余3个处理组去细胞彻底，1．00％TnBP加0．25％TritonX-100组胶原纤维完整、走形规则。1．00％TnBP加0．50％TritonX-100与1．00％TnBP加1．00％TritonX-100组胶原纤维完整，但间隙略增宽，最大载荷分别为（385．220±80．316）N、（398．220±127．195）N，抗张强度分别为（46．690±16．295）Mpa、（46．20±5．517）Mpa，羟脯氨酸含量分别为（0．2826630±0．0110109）μg/mg、（0．2793550±0．0102129）μg/mg，分别和新鲜对照组[最大载荷（533．280±135．774）N、抗张强度（65．560±14．401）Mpa、羟脯氨酸含量（0．2928820±0．0100988）μg/mg]相比，力学性能降低、羟脯氨酸含量减少，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论1．oo％TnBP加0．25％Tritonx-100处理是较理想的制备去细胞人体肌腱的方法。