大鼠心脏TNNT2基因的克隆及表达研究

目的克隆大鼠心脏TNNT2基因,研究其表达情况。方法以成年SD大鼠心脏为实验材料,提取其总RNA并反转录;根据Genebank中提供的大鼠TNNT2基因cDNA序列,利用PCR方法扩增此序列,并进行表达研究。结果克隆了大鼠心脏TNNT2基因cDNA全长,反转录后克隆出TNNT2cDNA全长并与Genebank中提供的序列对比发现了新的cNDA序列,递交至Genebank数据库,登陆号为:EU295527。组织表达谱研究表明TNNT2基因在大鼠心脏、肾、肝、脾、肺、肌肉中均有表达,以心脏中表达最高(P<0.05)。结论首次克隆了大鼠TNNT2cDNA,Genebank登陆号:EU295527。TNNT2基因在多种组织中有表达,在心脏中表达最高。

应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病

应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)小鼠进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒,把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中,通过实时定量PCR(Q-PCR)检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示,gRNA2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高,达到80%(P<0.0001)。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中,转导出生后1 d的DCM小鼠原代心肌细胞。Q-PCR检测结果表明,CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA敲低效率达到55%(P<0.01)。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中,再将200μL约1×1012AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内,待注射小鼠发育至5月龄时。Q-PCR检测结果显示,AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%(P<0.01)。对5月龄野生型(WT)、DCM(未注射病毒组)和AAV9+DCM(基因组编辑工具注射组)三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示:DCM小鼠的心血管形态异常,而AAV9+DCM小鼠心血管形态趋于正常。对3组小鼠的心脏进行超声心动图,并对心功能指标进行统计发现,DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数(left ventricular percent ejection fraction,LV EF%)、左心室短轴缩短率(left ventricular percent fractional shortening,LV FS%)分别下降50.4%(P<0.0001),55.1%(P<0.0001),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升66.5%(P<0.01),77.0%(P<0.01)。通过Q-PCR和天狼星红染色检测3组小鼠的心肌纤维化程度。结果显示,DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因,分别高表达5.2倍(P<0.001)、4.5倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降2.0倍(P<0.05)、1.4倍(NS)。天狼星红染色结果显示,纤维化区域明显下降;通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测3组小鼠的心肌心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平。结果表明,DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降2.8倍(P<0.05),Nppa蛋白表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变(gRNA 5T),以及正常的TNNT2 mRNA(gRNA 5V)序列分别组合转染到293T细胞中。通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 5T序列表达效率为30%(P<0.0001),而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141WmRNA的gRNA,特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA,有效改善了转基因小鼠的心功能,为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。

MYH7基因Arg453Cys突变及TNNT2基因Arg102Trp突变所致肥厚型心肌病的临床表型分析

目的分析携带MYH7基因Arg453Cys突变及TNNT2基因Arg102Trp突变的肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)患者的临床表型及预后特点。方法在接受过全外显子组测序的986例HCM患者中,分析携带上述两个突变的HCM患者的临床表型特点,并通过随访分析预后。结果在986例HCM患者中发现6例(0.6%)患者携带MYH7基因Arg453Cys突变,患者平均诊断年龄为(24.3±7.5)岁,发病年龄较小;随访过程中5例出现病情进展,其中2例出现心血管死亡。986例HCM患者中发现3例(0.3%)患者携带TNNT2基因Arg102Trp突变,均表现为轻度肥厚,平均左心室最大室壁厚度(left ventricular maximum wall thickness,LVMWT)为(17.33±2.05)mm;2例出现病情恶化,1例因心力衰竭死亡。结论MYH7基因Arg453Cys突变和TNNT2基因Arg102Trp突变在我国HCM患者中相对常见,虽然携带突变的患者临床表型异质性较大,但发生心血管死亡的风险较高。

利用CRISPR/Cas9技术构建tnnt2a基因突变斑马鱼及表型分析

心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)作为心肌纤维细肌丝的结构蛋白,参与心脏兴奋收缩耦联过程。tnnt2a为斑马鱼cTnT基因的亚型。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了可稳定遗传tnnt2a缺失突变斑马鱼。对tnnt2a缺失突变体进行表型分析,结果显示tnnt2a+/-斑马鱼心脏无明显异常,而tnnt2a-/-斑马鱼心脏在胚胎发育早期具有显著的突变表型,表现为心脏无搏动、心房和心室增大、心包积液,并于受精后6~7天死亡。运用real time RT-PCR检测tnnt2a、actc1a、tpm4a、myl7和vmhc基因在转录水平的表达情况,结果显示tnnt2a^-/^-(Δ2)斑马鱼tnnt2a基因在发育的各时间点表达水平均显著下降;而actc1a、tpm4a、myl7和vmhc基因在突变体胚胎发育早期表达增高,晚期则表达下降。进一步对心脏组织进行电镜观察和免疫荧光染色,结果显示tnnt2a^-/^-(Δ2)斑马鱼心脏无正常粗、细肌丝结构,同时F-actin与Tpm4的共染色也展示了心肌细胞肌丝结构的异常。本研究利用CRISPR/Cas9构建的tnnt2a突变斑马鱼表现出了心腔扩张,停搏及粗、细肌丝形成障碍等与临床扩张型心肌病相似的表型,因此可为TNNT2缺陷相关心肌病的研究提供很好的工具。

TNNT2基因Arg92Trp突变导致小鼠肥厚型心肌病的表型研究

目的编码心脏肌钙蛋白T的TNNT2基因是肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)的主要致病基因之一,其Arg92Trp变异是HCM的常见致病突变,但是目前尚未有TNNT2突变的基因敲入小鼠模型。本研究的目的是通过建立基因敲入小鼠模型,研究Arg92Trp突变对心脏结构功能的影响,观察是否能够复制人类HCM表型,为研究TNNT2突变导致HCM的机制以及干预治疗奠定基础。方法使用CRISPR/Cas9技术建立TNNT2基因Arg92Trp突变敲入小鼠,分别于8月龄、12月龄和22月龄通过超声心动图在体检测杂合型(TNNT2^(Arg92Trp/+))与野生型(wild type,WT)小鼠的心脏结构和功能,并于22月龄测量小鼠心重体重比及心肌病理改变。结果与人HCM表型相似,与WT小鼠相比,8月龄、12月龄和22月龄TNNT2^(Arg92Trp/+)小鼠左心室前壁和后壁均显著肥厚,心脏收缩功能增强。22月龄小鼠的Masson染色显示心脏出现纤维化,H-E染色显示肌纤维排列紊乱,WGA染色显示心肌细胞显著增大;但ANP和BNP表达未见显著改变。结论本研究首次建立了TNNT2基因突变的基因敲入小鼠模型。该小鼠模型基本能够模拟人类HCM表型。

中国肥厚型心肌病与肌钙蛋白T基因的相关性研究

目的研究肌钙蛋白T(Troponin T,TNNT2)在中国肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)患者中的突变情况。方法对95例无血缘关系的HCM先证者(其中22例为家族性HCM先证者)进行肌钙蛋白T基因(TNNT2)突变筛查,利用聚合酶链反应(PCR)扩增其功能区8、9、10、11、14、15、16号外显子片段,双脱氧末端终止法测序。家系资料调查包括:临床表现、体格检查、心脏超声和心电图。结果 16例FHCM患者及79例SHCM患者均未发现TNNT2基因的错义突变、移码突变、剪接突变。仅在9号外显子检出一同义突变,为ATC→ATT,均编码异亮氨酸(Ile)。结论 TNNT2不是我国肥厚型心肌病的常见致病基因。

脉冲电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外心肌样细胞分化的研究

观察脉冲电磁场(PEMFs)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)在体外向心肌样细胞分化的影响。选用第3代rBMSCs用于实验。实验分为PEMFs诱导组、5-氮胞苷(5-Aza)诱导组和对照组:PEMFs诱导组给予rBM-SCs 50 Hz1、mT低频脉冲电磁场刺激,30 min/d,分别刺激10 d、15 d和20 d;5-Aza诱导组给予rBMSCs 10μmol/L 5-Aza诱导1d,对照组不予处理;后两组与PEMFs诱导组同步培养10、15和20 d。通过倒置相差显微镜逐日连续观察细胞的生长状况和形态特征,采用实时荧光定量PCR检测肌钙蛋白T(TNNT2)mRNA和α-辅肌动蛋白(ACTN2)mRNA表达量的变化。结果显示:对照组rBMSCs呈纺锤形、多角形或梭形,随时间延长,细胞形态无明显变化;5-Aza或PEMFs诱导后,细胞形状逐渐变长,大量细胞聚集生长,且随着诱导时间的延长,聚集趋势不断增加,刺激20 d,细胞聚集呈长链状,高倍镜下可见细胞伸长明显,且部分细胞与邻近细胞融合。与对照组相比,5-Aza诱导组TNNT2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的19.40倍(P<0.01)、21.02倍(P<0.01)和2.38倍;ACTN2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的6.64倍(P<0.01)、6.67倍(P<0.01)和0.76倍。PEMFs诱导组中TNNT2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的15.78倍、6.73倍和2.73倍(均有P<0.05);ACTN2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应对照组的4.93倍(P<0.01)、1.89倍和0.64倍。而与5-Aza诱导组比较,PEMFs诱导组中TNNT2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应5-Aza诱导组的0.81倍、0.32倍(P<0.01)和1.15倍;ACTN2 mRNA在3个时间点的表达量分别为相应5-Aza诱导组的0.74倍、0.28倍(P<0.01)和0.83倍。本研究结果表明,在我们所选用的PEMFs条件下,PEMFs可以诱导rBMSCs在体外向心肌样细胞分化,最佳作用时间可能为第10 d。