circEIF6调节miR-129-5p/TRAF6轴对胰腺癌细胞增殖、凋亡和吉西他滨敏感性的影响

目的:探讨环状RNA真核起始因子6(circEIF6)调节miR-129-5p/肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)轴对胰腺癌细胞增殖、凋亡和吉西他滨(GEM)敏感性的影响。方法:将胰腺癌细胞SW1990分为对照组(正常培养)、si-NC组(转染si-NC)、si-circEIF6组(转染si-circEIF6)、si-circEIF6+inhibitor-NC组(si-circEIF6和inhibitor-NC共转染)、si-circEIF6+miR-129-5p inhibitor组(si-circEIF6和miR-129-5p inhibitor共转染);RT-qPCR检测circEIF6、miR-129-5p的表达水平;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫印迹检测TRAF6、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达;MTT法检测不同浓度GEM对细胞增殖抑制率的影响;双荧光素酶报告基因实验分别验证circEIF6和miR-129-5p、miR-129-5p和TRAF6的关系。结果:与对照组、si-NC组比较,si-circEIF6组circEIF6表达、OD490值、TRAF6、PCNA蛋白表达降低,miR-129-5p表达、细胞凋亡率、Bax、caspase-3蛋白表达升高;与si-circEIF6组、si-circEIF6+inhibitor-NC组比较,si-circEIF6+miR-129-5p inhibitor组OD490值、TRAF6、PCNA蛋白表达升高,miR-129-5p表达、细胞凋亡率、Bax、caspase-3蛋白表达降低;细胞增殖抑制率在GEM处理下以剂量依赖性的方式显著增加;与对照组比较,GEM处理下细胞的增殖抑制率、凋亡率显著升高,敲低circEIF6可提高GEM处理下细胞的增殖抑制率、凋亡率,而miR-129-5p inhibitor可减弱敲低circEIF6发挥的上述作用;circEIF6靶向负调控miR-129-5p的表达,miR-129-5p靶向负调控TRAF6的表达;双荧光素酶报告实验证实miR-129-5p与circEIF6和TRAF6存在靶向关系。结论:敲低circEIF6可能通过靶向miR-129-5p下调TRAF6表达,进而抑制胰腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡、提高胰腺癌细胞对GEM的敏感性。

抑制TRAF6调节炎症和自噬改善脓毒症小鼠的心肌损伤和心功能

目的 探索抑制TRAF6后对脓毒症小鼠心肌细胞自噬、炎症反应和心功能的改善作用。方法 (1)昆明雄性小鼠24只,随机分为4组,分别为假手术(sham)组、假手术+C25-140(sham+C)组、盲肠结扎穿刺术(CLP)组、盲肠结扎穿刺术+C25-140(CLP+C)组。sham+C组、CLP+C组术后腹腔注射C25-140。术后24 h超声评估LVEF、LVFS;ELISA测血清TNF-α、IL1-β;HE染色评估心肌炎症反应;透射电镜观察心肌细胞自噬小体、线粒体微结构;qPCR检测心肌组织TRAF6 mRNA;WB检测TRAF6、P62、Beclin-1、LC3B蛋白的表达;(2)予3-MA抑制自噬观察C25-140对脓毒症小鼠心肌损伤的影响。结果 (1)与sham组比,CLP组心肌组织TRAF6mRNA及TRAF6蛋白显著升高(P <0.05);血清TNF-α、IL1-β浓度显著升高(P <0.05);心肌组织HE染色见炎症细胞浸润;LVEF、LVFS显著降低(P <0.05);(2)与CLP组比,CLP+C组TRAF6 mRNA及TRAF6蛋白表达减少(P <0.05);血清TNF-α、IL1-β下降(P <0.05);心肌组织病理心肌炎症细胞浸润减少;LVEF、LVFS升高(P <0.05);电镜见线粒体肿胀减轻、自噬小体增多;Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达增加,P62表达减少(P <0.05);予3-MA抑制自噬后,与CLP+C组比,CLP+C+3-MA组小鼠心肌病理见炎症细胞浸润明显,LVEF、LVFS降低(P <0.05)。结论 抑制TRAF6改善脓毒症小鼠心肌炎症损伤和心功能障碍;抑制TRAF6促进心肌细胞自噬参与保护脓毒症诱导的心肌损伤。

牛蒡子苷元抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路对哮喘模型大鼠气道重塑和Th1/Th2免疫平衡的影响

目的研究牛蒡子苷元抑制Toll样受体4(TLR4)/肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF6)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对哮喘模型大鼠气道重塑和Th1/Th2免疫平衡的影响。方法构建急性哮喘大鼠模型,随机分为5组(每组12只模型大鼠):模型组、牛蒡子苷元低、高剂量组、脂多糖(LPS,TLR4激活剂)组、牛蒡子苷元+LPS组,以12只Wistar正常大鼠作为对照组。分组处理后,观察各组大鼠哮喘症状并做评分、分类计数各组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞、检测各组大鼠肺组织病理变化、血清IgE水平、BALF和血清中白细胞介素(IL)-4、干扰素γ(IFN-γ)水平、IFN-γ/IL-4及肺组织TLR4/TRAF6/NF-κB通路相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠肺组织产生严重病理损伤,哮喘症状评分、WAt/Pbm、WAm/Pbm、BALF中巨噬细胞及淋巴细胞计数、血清IgE水平、BALF与血清中IL-4水平、肺组织TLR4、TRAF6表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(P<0.05),BALF与血清中Th1型细胞因子IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4降低(P<0.05);与模型组相比,各牛蒡子苷元处理组中模型鼠的上述改变均被扭转,且高剂量牛蒡子苷元作用更强;LPS组大鼠各指标变化与牛蒡子苷元处理组相反,另外LPS可逆转高剂量牛蒡子苷元对大鼠各指标的作用。结论牛蒡子苷元可通过抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信号激活而阻止哮喘大鼠气道炎症,促使Th1/Th2免疫平衡向Th1转移,改善大鼠气道重塑和肺损伤。

异甘草素抑制RANKL/RANK/TRAF6信号通路对骨质疏松大鼠成骨细胞分化的影响

目的探究异甘草素对骨质疏松(OP)大鼠成骨细胞分化的影响是否与调控核因子-κB受体活化体配体(RANKL)/核因子-κB受体活化体(RANK)/肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)信号通路有关。方法采用去势法建立绝经后OP大鼠模型,造模2周后将大鼠随机分为模型组、阳性组(戊酸雌二醇0.09 mg/kg)、异甘草素低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量组,每组10只,另取10只大鼠作为假手术组。给药结束后采用ELISA法检测大鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)、雌二醇(E_(2))水平;Micro-CT扫描观察骨微结构指标;HE染色观察股骨组织病理学;免疫组化法检测大鼠股骨Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达;Western Blot法检测大鼠股骨RANKL、RANK、TRAF6蛋白表达。结果与模型组比,阳性组与异甘草素各剂量组大鼠骨组织病变明显减轻,可见新生骨小梁;ALP[(107.94±9.83)U/L、(75.27±7.51)U/L、(89.35±9.14)U/L、(106.33±10.02)U/L比(53.79±5.62)U/L]、E_(2)[(27.71±2.67)pg/mL、(18.36±1.82)pg/mL、(23.65±2.28)pg/mL、(27.46±2.71)pg/mL比(14.64±1.59)pg/mL]水平,Tb.Th[(0.36±0.04)mm、(0.23±0.02)mm、(0.28±0.03)mm、(0.36±0.03)mm比(0.12±0.01)mm]、Tb.N[(4.45±0.44)1/mm、(2.67±0.27)1/mm、(3.36±0.34)1/mm、(4.41±0.44)1/mm比(1.51±0.12)1/mm]、BMD[(0.37±0.04)g/cm^(2)、(0.22±0.02)g/cm^(2)、(0.29±0.03)g/cm^(2)、(0.38±0.03)g/cm^(2)比(0.14±0.01)g/cm^(2)]、BV/TV[(11.94±1.23)%、(7.12±0.70)%、(8.49±0.85)%、(11.77±1.16)%比(5.75±0.61)%]以及Runx2表达[(0.84±0.08)、(0.41±0.04)、(0.59±0.06)、(0.82±0.08)比(0.27±0.03)]升高(P<0.05),Tb.Sp[(0.25±0.02)mm、(0.43±0.04)mm、(0.34±0.03)mm、(0.23±0.02)mm比(0.56±0.06)mm]以及RANKL[(0.42±0.04)、(0.86±0.08)、(0.64±0.06)、(0.45±0.04)比(1.09±0.11)]、RANK[(0.39±0.04)、(0.81±0.08)、(0.67±0.06)、(0.41±0.04)比(1.03±0.10)]、TRAF6[(0.47±0.05)、(0.77±0.08)、(0.61±0.06)、(0.49±0.05)比(0.96±0.09)]蛋白表达降低(P<0.05),且异甘草素呈剂量依赖性。结论异甘草素可能通过抑制RANKL/RANK/TRAF6信号通路,促进成骨细胞分化,改善股骨病变,有效发挥对OP的治疗作用。

安肠汤通过TRAF6/IRAK1/NF-κB信号通路对溃疡性结肠炎大鼠的抑制作用研究

目的:从TRAF6/IRAK1/NF-κB信号通路角度观察安肠汤对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的作用及机制。方法:选择60只实验大鼠,除空白组10只外,其余各组均采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol,TNBS)/乙醇灌肠法建立UC大鼠模型,造模成功大鼠分为模型组,美沙拉嗪组,安肠汤低、中、高剂量组,每组10只。空白组、模型组灌胃生理盐水,美沙拉嗪组采用美沙拉嗪混悬液灌胃,安肠汤各剂量组给予对应剂量安肠汤灌胃。给药14天后处死各组大鼠。观察各组大鼠结肠病理改变;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测大鼠血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)水平;Western blot法检测结肠组织中TNF受体关联因子6重组蛋白(recombinant tnf receptor associated factor 6,TRAF6)、白细胞介素1受体相关激酶(recombinant interleukin 1receptor associated kinase 1,IRAK1)、磷酸化细胞核因子NF-κB抗体(phosphorylated nuclear factor NF-κB antibody,p-NF-κB)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白的表达;通过定量聚合酶链反应测定大鼠结肠组织中TRAF6、IRAK1、NF-κB mRNA的相对表达量。结果:与空白组比较,模型组结肠黏膜病理受损严重,血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高,结肠组织中TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB蛋白表达上调(P<0.05)。与模型组相比,安肠汤各剂量组和美沙拉嗪组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著降低(P<0.05);结肠组织中TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB蛋白表达下调(P<0.05)。结论:安肠汤对TNBS诱导的UC大鼠有治疗作用,其作用可能与其调节TRAF6/IRAK1/NF-κB通路及相关炎症因子,从而减轻肠道炎症反应,缓解肠黏膜损伤有关。

circRASA2靶向miR-543/TRAF6轴对LPS诱导的牙周膜细胞增殖和成骨分化的影响

目的:探讨circRASA2在牙周炎中的可能作用及其潜在调控机制。方法:采用脂多糖(LPS)诱导牙周膜细胞(PDLCs),建立牙周炎细胞模型。CCK-8实验检测细胞增殖活性,Transwell小室实验检测细胞迁移能力,Western印迹法检测细胞中成骨分化相关蛋白表达。分别利用数据库circinteractome和starBase预测circRASA2的靶miRNA及下游靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验验证目的基因之间的靶向关系。采用GraphPad Prism 8.0软件包对数据进行统计分析。结果:circRASA2在LPS处理的PDLCs细胞中高表达;LPS诱导PDLCs细胞增殖活力、迁移能力和成骨分化能力降低,而敲低circRASA2能促进LPS处理下PDLCs的增殖、迁移和成骨分化能力。circRASA2靶向并负调控miR-543的表达,过表达miR-543能促进LPS处理下PDLCs的增殖、迁移和成骨分化能力。TRAF6是miR-543的下游靶基因,敲低circRASA2可通过miR-543的海绵作用,下调TRAF6的表达。过表达TRAF6能逆转circRASA2敲低对PDLCs增殖、迁移和成骨分化能力的促进作用。结论:circRASA2通过miR-543/TRAF6轴在体外加速牙周炎的病理进程,通过靶向降低circRASA2的表达,可能改善牙周炎症状。

鸡TIFA和TRAF6蛋白的分子特征及其基因在免疫器官中的表达特性

【目的】明确鸡肿瘤坏死因子受体相关因子相互作用的具有叉形头相关结构域蛋白(TIFA)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的分子特征及其基因在鸡免疫器官中的表达特性,为后续深入研究TIFA和TRAF6相互作用调控家禽病毒NDV复制的作用机制提供理论依据。【方法】采用生物信息学软件结合实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,通过分析鸡TIFA和TRAF6蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、氨基酸同源性和结构域保守性及其在1~6月龄白来航鸡和新城疫病毒(NDV)感染SPF鸡后第3~5天的免疫器官(脾脏、胸腺和法氏囊),分别检测鸡免疫器官中TIFA和TRAF6基因的表达水平,进而研究鸡TIFA和TRAF6蛋白的分子特征及其基因在免疫器官中的表达特性。【结果】鸡TIFA和TRAF6蛋白分别含有187和545个氨基酸残基,相对分子量约为21.8和61.9 kDa,其二级结构均主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。氨基酸同源性分析结果表明,鸡与火鸡TIFA和TRAF6蛋白的氨基酸同源性最高,分别为97.3%和98.2%,而与猪TIFA及小鼠TRAF6蛋白的氨基酸同源性最低,分别为51.1%和74.7%。同时,鸡TIFA蛋白的FHA结构域及TRAF6蛋白的RING、Zinc finger和MATH结构域均在禽类中保守性高。RT-qPCR分析结果表明,鸡TIFA和TRAF6基因在1~6月龄鸡免疫器官中均存在表达,但在脾脏中的相对表达量最高(47.94和10.84),而在法氏囊中最低(8.08和2.01),其中,TIFA基因在1月龄鸡免疫器官中表达量最高(22.15),在6月龄时最低(1.11),呈先减后增再减趋势,整体表达趋势呈倒“N”型模式;TRAF6基因在4月龄鸡免疫器官中表达量最高(7.13),在5月龄时最低(1.05),呈先降后升再降再升趋势,整体表达趋势呈“W”型模式。在NDV感染SPF鸡后的免疫器官中,TIFA和TRAF6基因的相对表达量均显著高于对照,其中,TIFA基因在第3天的鸡脾脏、第4天的鸡胸腺和法氏囊中的表达量最高,而TRAF6基因则在第3天的鸡脾脏、第5天的鸡胸腺和法氏囊中的表达量最高。【结论】鸡TIFA和TRAF6蛋白在禽类中的保守性高,两者在不同月龄鸡和NDV感染鸡的免疫器官中呈不同的表达水平和表达变化趋势,其参与的先天性免疫应答可能在抵抗NDV感染过程中发挥一定作用。

miRNA146a通过TRAF6下调IFNβ的表达

目的探讨miRNA146a通过TRAF6下调IFNβ的表达情况。方法设计TRAF6基因3’UTR区miRNA146a结合位点的野生型引物,随后预测IRF-3及TRAF6基因3’UTR区域可能的miRNA结合位点,以人cDNA为模板,进行PCR目的片段扩增,将HeLa细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液进行传代培养,并进行细胞RNA提取,逆转录,进行实时定量RT-PCR、免疫印迹实验。结果miRNA146a、miRNA23a、miRNA24k可上调IRF-3启动子活性,通过表达miRNA146a转染细胞检测IFNβ通路上游分子TRAF6、IRAK1、NF-κB,提示miRNA146a、TRAF6、IRAK1、NF-κB均明显下降,表达miRNA146a降低pGL3c-TRAF6-3UTR萤光素酶活性,干扰miRNA146a可上调萤光素酶活性,miRNA146a下调TRAF6表达,TRAF6 siRNA下调PolyI:C激活的IFNβ启动子活性,TRAF6 siRNA较对照能够显著增加miRNA146a对IFNβ启动子下调作用。结论IRF-3及IFNβ可能是EB病毒诱导宿主miRNA的调控靶点,为防治EB病毒相关疾病提供新的思路。

紫草素通过调节RANKL/RANK/TRAF6及其介导的NF-κB/MAPKs信号通路与氧化应激来改善激素性骨质疏松

目的评估紫草素对激素诱导的大鼠骨质疏松的影响及其潜在机制。方法不同浓度紫草素处理RAW264.7细胞系,CCK8实验评估紫草素对细胞活力的影响;将细胞分为5个组:对照组、地塞米松(骨质疏松诱导剂)组、地塞米松+重组人甲状旁腺(抗骨质疏松剂)组、地塞米松+紫草素0.3μmol·L^(-1)组,及地塞米松+紫草素1.2μmol·L^(-1)组,通过TRAP染色及骨吸收面积测定评估紫草素对破骨细胞功能影响。构建地塞米松诱导大鼠骨质疏松大鼠模型,并分为5个组(n=8):地塞米松组、地塞米松+重组人甲状旁腺素组、地塞米松+紫草素0.3μmol·L^(-1)组与地塞米松+紫草素1.2μmol·L^(-1)组,设置正常对照组,分别给予:0.9%NaCl6 mL·kg^(-1),每3天PTH 20μg·kg^(-1),每天紫草素0.5 mg·kg^(-1)(0.3μmol·L^(-1)),每天紫草素2 mg·kg^(-1)(1.2μmol·L^(-1)),0.9%NaCl 6 mL·kg^(-1)共3周;ELISA检测血清I型胶原蛋白(CTX)、血清组织蛋白酶K(Cathepsin K)及氧化应激相关指标变化;HE染色检测大鼠骨结构变化,双能X线扫描检测大鼠骨密度(BMD)变化;Western blot及免疫荧光检测紫草素体外对NF-κB/MAPKs信号通路的影响,Western blot及qRT-PCR检测RANKL相关蛋白及mRNA表达,Western blot检测紫草素对RANKL/TRAF6的阻断作用。结果1.2μmol·L^(-1)紫草素对细胞存活率影响最小;紫草素降低了TRAP阳性细胞数量(P<0.05);紫草素降低了骨吸收面积(P<0.05);紫草素降低了CTX及Cathepsin K表达(P<0.05),且1.2μmol·L^(-1)紫草素组降低更显著(P<0.05);紫草素提高了大鼠股骨BMD(P<0.05),且1.2μmol·L^(-1)紫草素组上升更显著(P<0.01);紫草素可以逆转地塞米松引起的骨小梁减少与变薄;紫草素提高了大鼠体内SOD及GSH表达水平(P<0.05),并降低了MDA表达水平(P<0.05);紫草素体外抑制NFκB通路相关蛋白磷酸化;紫草素抑制RANK、RANKL、TRAF6、c-fos及NFATc1蛋白和mRNA表达;且紫草素阻断RANKL诱导剂促进TRAF6表达。结论紫草素可以通过抑制RANKL/RANK/TRAF6及其介导的NF-κB/MAPKs信号通路来改善大鼠激素诱导的骨质疏松。

苗药金乌健骨胶囊对胶原诱导关节炎模型大鼠肠道、滑膜炎症及IL-17α/TRAF6/NF-κB信号通路的影响

目的探讨苗药金乌健骨胶囊对胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠肠道、滑膜炎症及参与NF-κB信号通路基因IL-17受体信号分子ACT1(nuclear factor kappa B activator 1,ACT1)、泛素化TRAF6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)、转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)、核因子-κB上游激酶(IκB kinaseα,IKKα)、核因子κB/p65、核因子κB/p50表达的影响。方法将70只SPF级6~8周龄雌性Wistar大鼠随机分为7组,分别为空白对照组、模型组、金乌健骨胶囊低剂量组、金乌健骨胶囊中剂量组、金乌健骨胶囊高剂量组、甲氨蝶呤组及益生菌组,每组10只。适应性喂养后除空白对照组外,其余6组构建CIA模型,两次免疫造模成功后分别进行药物金乌健骨胶囊、甲氨蝶呤、益生菌灌胃治疗,治疗4周后静脉取血,处死大鼠,分离大鼠滑膜组织及肠道组织。利用HE染色法检测大鼠滑膜及大肠组织病理情况;ELISA法检测大鼠血清TGF-β1、IL-1α、IL-17α、IL-21、IL-23的含量;Western blot法检测大鼠肠道组织ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50蛋白的表达水平;RT-qPCR法检测大鼠肠道ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因的表达情况。结果滑膜病理结果显示,与模型组相比,金乌健骨胶囊中、高剂量组和甲氨蝶呤组炎性浸润、增生、血管新生组织有明显改善;肠道病理结果显示,与模型组相比,金乌健骨胶囊低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组、益生菌组肠道组织细胞可见少量炎性细胞浸润,肠道组织细胞病变情况较模型组有不同程度的改善;ELISA结果显示,与模型组相比,各给药组血清含量显著降低(P<0.05或P<0.01);Western blot结果显示,各给药组大鼠肠道组织ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50的蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01);RT-qPCR结果显示,各给药组ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因的表达显著降低(P<0.05或P<0.01);金乌健骨胶囊高剂量组的作用最佳。结论苗药金乌健骨胶囊能够减轻CIA大鼠肠道、滑膜炎症,同时能够影响肠道IL-17α/TRAF6/NF-κB信号途径相关基因的表达情况。

反向PCR法构建TRAF6蛋白截短体质粒

目的:构建肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)截短体质粒pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C。方法:采用反向PCR法。结果:经双酶切鉴定,分别得到约900和750 bp的TRAF6截短体质粒pCMVMyc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C,符合预期;转染293FT细胞后,Western印迹检测到TRAF6 N和TRAF6 C的表达。结论:构建了TRAF6蛋白截短体质粒,有助于进一步验证TRAF6的生物学功能。

隔药灸对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜MyD88及TRAF6表达的影响

目的:观察隔药灸对UC大鼠结肠黏膜MyD88与TRAF6表达的影响,探讨隔药灸治疗UC的效应机制。方法:采用免疫学合并局部刺激方法复制实验性溃疡性结肠炎大鼠模型。将40只SD大鼠随机分为正常组(NC)、模型组(MC)、隔药灸组(HMP)、维柳芬组(SASP),每组10只。隔药灸组于双侧天枢穴、气海穴施以隔药灸治疗,2壮/穴,1次/d,共8 d;维柳芬组以柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液灌胃,2次/d,共8 d;正常组、模型组大鼠同步饲养,做与各干预组相同的抓取固定。干预结束后,收集结肠组织,免疫组化法检测结肠黏膜MyD88、TRAF6的表达,半定量图像分析。结果:隔药灸可明显改善UC大鼠结肠黏膜损伤程度及病理学评分(P<0.01),且与维柳芬作用相当(P>0.05);模型大鼠结肠黏膜MyD88与TRAF6的表达较正常大鼠明显增高(P<0.01),隔药灸干预后,结肠黏膜MyD88与TRAF6的表达显著降低(P<0.01),作用与维柳芬相当(P>0.05)。结论:调控TLR/MyD88/NF-κB信号转导通路中MyD88、TRAF6的表达是隔药灸调节溃疡性结肠炎结肠黏膜局部过激免疫炎症反应的作用途径之一。

脑络欣通降低局灶性脑缺血再灌注大鼠额顶叶皮质TLR4及TRAF6和TNF-α蛋白的表达

目的观察脑络欣通对脑缺血再灌注大鼠额顶叶皮质Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白表达的影响。方法采用改良线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)大鼠右侧脑缺血模型,SD大鼠随机分为假手术组、模型组、通心络组和脑络欣通组,每组30只;再分为3、7、14 d三个亚组,灌胃给药。Western blot法检测缺血侧额顶叶皮质TLR4、TRAF6的蛋白水平,免疫组织化学染色法检测缺血侧额顶叶皮质缺血半暗带TNF-α的表达。结果与假手术组比较,模型组3、7、14 d,TLR4、TRAF6蛋白水平显著升高;与模型组比较,各治疗组3、14 d的TLR4、TRAF6蛋白水平显著降低,脑络欣通组7 d显著降低;与通心络组比较,脑络欣通组3、7 d的TLR4的蛋白水平降低,14 d的TLR4蛋白水平升高。与假手术组比较,模型组3、7 d的TNF-α蛋白表达的阳性面积显著升高;与模型组比较,脑络欣通组和通心络组7、14 d的TNF-α蛋白表达的阳性面积显著降低,脑络欣通组3 d的TNF-α蛋白表达的阳性面积显著降低;与通心络组比较,脑络欣通组各时间点TNF-α蛋白表达的阳性面积均无明显差异。结论脑络欣通通过降低TLR4、TRAF6、TNF-α蛋白表达,减轻炎症反应,减轻脑缺血再灌注损伤。

半滑舌鳎TRAF6基因和TAK1基因的克隆及表达分析

本研究通过同源克隆和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)的c DNA全长,并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。结果表明,TRAF6 c DNA全长1956 bp,开放阅读框(ORF)为1731 bp,编码576个氨基酸。二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域:N端的RING结构,两个锌指结构以及C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构和高度保守的MATH同源结构。TAK1 c DNA全长2519 bp,ORF为1731 bp,编码576个氨基酸。TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构域。系统进化树分析表明,半滑舌鳎TRAF6和TAK1分别与牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6和TAK1聚为一支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,TRAF6和TAK1在所检测的8种组织中都有表达,TRAF6在鳃中的表达最高,肠中也有较高的表达;TAK1在心脏中的表达量最高,其次是肾。TRAF6和TAK1在鳃、肾等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对TRAF6和TAK1在早期胚胎发育时期的表达情况进行检测,结果显示,在未受精卵中可检测到TRAF6和TAK1,提示了这两种免疫分子的母源性m RNA遗传的可能性。免疫分子母源性m RNA可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。

荆芥挥发油对流感病毒性肺炎小鼠Myd88、TRAF6蛋白表达影响

目的:观察荆芥挥发油(VOHS)对流感病毒性肺炎小鼠Myd88、TRAF6蛋白表达的影响,探讨荆芥挥发油治疗流感病毒性肺炎的细胞信号调控转导机制。方法:60只小鼠随机分为6组,分别为空白对照组、模型对照组、阳性药对照组(利巴韦林),VOHS预防给药组(0.110mg/kg)、VOHS高剂量组(0.110mg/kg),VOHS低剂量组(0.028mg/kg),灌胃给药,除预防给药组于造模前3d给药外,其余各组均于造模前1d给药。以10倍LD50浓度的流感病毒滴鼻感染,第6d处死动物。用Western blotting法检测小鼠肺组织中Myd88、TRAF6蛋白表达。结果:与模型对照组比较,VOHS预防组可显著降低小鼠肺组织中的TRAF6相对蛋白表达量,差异有统计学意义,对于Myd88蛋白表达有一定抑制趋势,但无统计学意义。结论:荆芥挥发油可通过抑制TLR信号转导通路的重要接头分子Myd88和关键分子TRAF6的蛋白表达对抗流感病毒性肺炎。

shRNA沉默TRAF6基因对急性肝损伤小鼠炎症反应的影响

目的通过shRNA沉默肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumour necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)基因表达,研究TRAF6沉默基因对内毒素/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)诱导的急性肝衰竭小鼠炎症反应的影响。方法通过体外实验筛选针对TRAF6基因的最有效小干扰RNA(siRNA)序列,采用流体力学注射法将pTRAF6-shRNA表达质粒转染BALB/c小鼠,24h后重复注射1次。第2次注射后24h,予LPS/D-GalN腹腔注射制备急性肝衰竭内毒素炎症模型。设正常对照组、模型对照组、空白质粒/LPS组及RNAi/LPS组。观察各组小鼠肝脏病理变化,Real-time PCR检测TRAF6、IL-6及COX-2mRNA的表达,ELISA检测血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平变化,Western blot检测肝细胞TRAF6、NF-κB p65的表达。结果 Real-time PCR及Western blot检测显示,pTRAF6-shRNA1能有效沉默TRAF6mRNA及蛋白表达,其中TRAF6mRNA表达较正常小鼠下降约60.13%,TRAF6蛋白表达降低约52.08%,差异均有统计学意义(均P<0.01)。ELISA检测显示各组小鼠TNF-α、IL-1β均于造模后8h达到峰值,TGF-β1于16h达到峰值;RNAi/LPS组小鼠血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平明显低于同时间点模型对照组。Real-time PCR结果显示RNAi/LPS组小鼠IL-6、COX-2及TRAF6mRNA表达下降,与模型对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。Western blot结果显示RNAi/LPS组小鼠肝组织总蛋白NF-κB p65表达水平显著高于正常对照组(P<0.05),与模型对照组无差异,而胞核NF-κB p65明显低于模型对照组(P<0.05)。结论 pTRAF6-shRNA可能通过下调NF-κB p65水平,抑制炎症相关细胞因子和炎性介质表达水平,从而减轻内毒素/半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤。

TRAF6截短体的构建及其对NF-κB信号通路的影响

目的构建肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)截短体,鉴定TRAF6截短体及对核因子-κB(NF-κB)信号通路的影响区域。方法采用PCR技术扩增TRAF6 4个截短体(N1、N2、N3、C1)编码基因,分别将其构建在pFlag-CMV2重组载体,用荧光素酶报告基因方法对TRAF6 4个截短体功能活性进行验证。结果成功将TRAF6截短体编码基因构建至pFlag-CMV2载体,截短体命名为N1、N2、N3、C1,通过荧光素酶报告基因实验证明TRAF6N3对NF-κB信号通路有增强效应。结论 TRAF6通过截短体N3区域对NF-κB信号通路产生增强效应。

牛TRAF6基因编码区的克隆及序列分析

为了探讨牛TRAF6基因的结构与功能,采用基因克隆技术分离了牛TRAF6基因的编码区序列,并采用生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的序列特征、结构和功能。结果表明:分离了TRAF6基因1803 bp的cDNA序列(GenBank登录号为DQ471669),编码区长度为1 629 bp,编码542个氨基酸(GenBank登录号为ABF06558),位于细胞核、细胞质、线粒体、内质网等多种细胞器上,分子量为61.57176 ku,等电点为6.09,含有RING-finger、zf-TRAF和MATH_TRAF6结构域。该蛋白与人、小鼠和大鼠TRAF6蛋白的同源性分别为89%、84%和82%,其结构域的同源性均达到95%以上。根据各物种间TRAF6蛋白的高同源性,结合人和小鼠TRAF6蛋白在TNF/TLRs/TIR超家族介导的信号转导途径中的重要作用,推测牛TRAF6蛋白也可能参与调节多种信号通路,在免疫反应、炎症反应、细胞分化和凋亡等生物学过程中发挥重要功能。

miR-146a-5p抑制TRAF6/NF-кB信号通路影响滋养细胞的炎症反应

目的:探讨微小核糖核酸(miR)-146a-5p与子痫前期的关系及作用机制。方法:对体外培养绒毛膜癌细胞JEG-3,经脂多糖(LPS)诱导后,与空白对照组相比,检测在LPS诱导的JEG-3细胞中miR-146a-5p和TRAF6的表达。设计分组分为control组、LPS组、miR-146a-5p mimic组、miR-146a-5p inhibitor组。通过QPCR定量检测各组JEG-3细胞中miR-146a-5p以及白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-a(TNF-α)的mRNA水平;利用Western Blot检测JEG-3细胞内TRAF6/NF-κB通路相关蛋白的表达。结果:(1)miR-146a-5p mimic组的miR-146a-5p表达明显高于其余3组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组相比,LPS诱导的JEG-3细胞中miR-146a-5p的表达量增加,TRAF6表达量明显下调(P<0.05)。(3)与对照组比较,加入miR-146a mimic后IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平明显下降(P<0.05),加入miR-146a inhibitor后IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平明显增加(P<0.05),与LPS组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)Western Blot结果显示加入miR-146a mimic后JEG-3细胞内TRAF6、NF-κB蛋白的表达较对照组明显下降;加入miR-146a inhibitor后JEG-3细胞内TRAF6、NF-κB蛋白的表达则明显升高。结论:miR-146-5p可能通过抑制TRAF6/NF-κB信号通路影响子痫前期母胎界面的炎症反应。