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利用GFP-Trap技术筛选与TaTLP1相互作用的蛋白 被引量:4
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作者 王菲 杨毅清 +3 位作者 武文月 崔钟池 王海燕 刘大群 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期76-82,共7页
小麦类甜蛋白基因TaTLP1,在植物抗病防御反应中起重要作用。为筛选与TaTLP1相互作用的蛋白,本研究拟通过Gateway定向克隆技术构建带有GFP标签的重组载体TaTLP1-pEarleyGate103,在烟草中完成异源表达。利用GFP-Trap技术获得与TaTLP1互作... 小麦类甜蛋白基因TaTLP1,在植物抗病防御反应中起重要作用。为筛选与TaTLP1相互作用的蛋白,本研究拟通过Gateway定向克隆技术构建带有GFP标签的重组载体TaTLP1-pEarleyGate103,在烟草中完成异源表达。利用GFP-Trap技术获得与TaTLP1互作的蛋白,质谱分析明确其种类。通过Western blot检测TaTLP1表达情况,以GFP抗体检测,膜上曝光结果显示,在约44 kD处出现条带,证明TaTLP1蛋白在烟草中成功表达;质谱分析GFP-Trap获得的洗脱蛋白,表明获得的候选互作蛋白中定位于胞外的病程相关蛋白1(Pathogenesisrelated protein 1, PR1)、非特异性脂质转移蛋白(Non-specific lipid-transfer protein, nsLTPs)等可能与TaTLP1存在互作。该试验为探索TaTLP1参与小麦抗叶锈病基因Lr19的防御反应机制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 小麦叶锈病 Gateway克隆 GFP-trap 蛋白互作
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环形泰勒虫TRAP-A蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定 被引量:1
2
作者 田占成 独军政 +5 位作者 高闪电 杜晓悦 于瑞明 刘光远 罗建勋 殷宏 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第1期60-65,共6页
为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PC... 为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PCR扩增获得576 bp的基因片段,将其连接到线性化载体pGBKT7上。经双酶切鉴定和序列分析以及重组诱饵质粒在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性及其表达情况检测,结果显示,本研究成功构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A,构建的诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无自激活活性和细胞毒性,且构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌内正确表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以用于筛选小亚璃眼蜱唾液腺酵母双杂交c DNA文库,获得可能与环形泰勒虫TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。 展开更多
关键词 酵母双杂交系统 环形泰勒虫 trap-A蛋白 自激活 细胞毒性
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靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建 被引量:3
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作者 钱晓彬 成静 陈淼 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2004年第416期476-478,共3页
目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构... 目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。 展开更多
关键词 端粒酶调节相关基因 基因表达 RNA干扰
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稳定转染ShRNA-TRAP对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响 被引量:1
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作者 钱晓彬 成静 +4 位作者 王瑛 姜润秋 陶艳 乔纯 冯振卿 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期42-46,共5页
目的探讨稳定转染靶向端粒酶调节相关基因TRAP的小发夹RNA对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响。方法构建特异性作用于TRAPmRNA的小发夹RNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选的阳性克隆细胞继续压力培养3个月,采用RT-PCR法检测TRAPmRNA的... 目的探讨稳定转染靶向端粒酶调节相关基因TRAP的小发夹RNA对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响。方法构建特异性作用于TRAPmRNA的小发夹RNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选的阳性克隆细胞继续压力培养3个月,采用RT-PCR法检测TRAPmRNA的表达,MTT法检测细胞生长,同时检测细胞凋亡、hTERTmRNA、端粒酶活性。结果稳定转染ShRNA-TRAP后,SGC-7901细胞的TRAPmRNA表达明显下降,hTERTmRNA和端粒酶活性降低;细胞增殖能力降低,细胞凋亡率增加。结论ShRNA-TRAP能长效的抑制TRAPmRNA的表达,下调hTERTmRNA转录及端粒酶活性,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,可作为抑制端粒酶的肿瘤基因治疗策略的补充。 展开更多
关键词 端粒酶 端粒酶调节相关基因 RNA干扰 小发夹RNA
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二酰甘油通过诱导中性粒细胞胞外捕获网抑制牙龈上皮角化屏障
5
作者 崔雅云 周敏 章燕 《口腔生物医学》 2024年第4期200-205,共6页
目的:探讨二酰甘油(DG)诱导中性粒细胞胞外捕获网(NETs)生成和潜在的调控机制,评估NETs对牙龈上皮角化屏障的影响。方法:从MTBLS4684数据库中获取牙周炎和健康受试者的脂质组学数据,对其进行标准化处理,分析两组中DG的含量差异。使用DG... 目的:探讨二酰甘油(DG)诱导中性粒细胞胞外捕获网(NETs)生成和潜在的调控机制,评估NETs对牙龈上皮角化屏障的影响。方法:从MTBLS4684数据库中获取牙周炎和健康受试者的脂质组学数据,对其进行标准化处理,分析两组中DG的含量差异。使用DG处理人外周血多形核中性粒细胞(PMNs)后,通过Western blot检测瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)表达,Sytox green染色检测胞外核酸变化,免疫荧光检测CitH3表达及分布的变化。使用蛋白激酶C(PKC)抑制剂预处理PMNs后,再加入DG刺激,通过Western blot、Sytox green染色和免疫荧光检测NETs形成。提取NETs刺激人牙龈角质形成细胞(HGKs),采用实时荧光定量PCR和Western blot检测兜甲蛋白(LOR)和紧密连接蛋白2(CLDN2)的表达变化。通过免疫组化检测健康和牙周炎组牙龈上皮中LOR和CLDN2的表达,并使用Western blot检测牙龈上皮中NETs标志物CitH3和髓过氧化物酶(MPO)蛋白表达。结果:牙周炎患者牙龈上皮中多种DG含量增高。DG刺激PMNs后,CitH3蛋白表达增加(P<0.01),核酸释放到细胞外,CitH3荧光表达增强并向细胞外分布;使用PKC抑制剂后,上述过程被有效抑制。NETs刺激HGKs细胞后,角化标志物LOR和屏障标志物CLDN2基因和蛋白表达降低(P<0.05)。牙周炎患者牙龈上皮中LOR和CLDN2表达降低,CitH3和MPO蛋白表达增加(P<0.05)。结论:DG通过激活PMNs中的PKC促进NETs形成和累积,进而破坏牙龈上皮的角化和屏障功能。 展开更多
关键词 牙周炎 中性粒细胞胞外捕获网 二酰甘油 蛋白激酶C 角化屏障
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RNA结合基序蛋白15在脓毒症小鼠心肌中的表达及与中性粒细胞胞外诱捕网的相关性
6
作者 刘纯瑶 杨丽婷 +2 位作者 牛泽粟 胡怡 潘东峰 《宁夏医科大学学报》 2024年第6期563-570,共8页
目的探讨RNA结合基序蛋白15(RBM15)在脓毒症心肌损伤小鼠中的表达及与中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的相关性。方法腹腔注射脂多糖(LPS)建立小鼠脓毒症模型,以生理盐水处理小鼠作为对照组。LPS注射7 d后采用心脏多普勒超声检测小鼠心脏功... 目的探讨RNA结合基序蛋白15(RBM15)在脓毒症心肌损伤小鼠中的表达及与中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的相关性。方法腹腔注射脂多糖(LPS)建立小鼠脓毒症模型,以生理盐水处理小鼠作为对照组。LPS注射7 d后采用心脏多普勒超声检测小鼠心脏功能;采用HE染色观察脓毒症小鼠心肌损伤情况;免疫荧光染色法检测心肌组织切片中瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)表达水平;ELISA法检测心肌组织中CitH3、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和血浆中髓过氧化物酶(MPO)的酶活性;RT-qPCR检测中性粒细胞相关分子[人核因子κB抑制蛋白α(ⅠκBα)、核因子κB(NF-κB)、B-细胞淋巴瘤因子10(Bcl10)、肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)]、RBM15及N6-甲基腺嘌呤(m6A)甲基化酶[甲基转移酶样3(METTL3)、甲基转移酶样14(METTL14)、肾母细胞瘤1关联蛋白(WTAP)、KIAA1429]。Western blot检测中性粒细胞相关分子ⅠκBα、核因子κB/p65(NF-κB/p65)、核因子κB/p50(NF-κB/p50)、Bcl10、PAD4、RBM15及m6A甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429。结果心脏多普勒超声检测小鼠心脏功能结果显示,与对照组相比,实验组小鼠左心室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)均降低(P均<0.001);HE染色结果显示,对照组小鼠心肌组织结构正常,实验组小鼠心肌部分断裂,可见炎性细胞浸润,细胞水肿;免疫荧光染色结果显示,实验组CitH3荧光强度增强,表达上调(P<0.05);ELISA结果显示,与对照组相比,脓毒症小鼠心肌组织中NETs相关分子CitH3、NE及血浆中MPO均升高(P均<0.01);RT-qPCR结果显示,与对照组相比,实验组Bcl10(P=0.960)、PAD4(P=0.324)、METTL14(P=0.592)、WTAP(P=0.505)mRNA表达水平差异均无统计学意义,ⅠκBα(P<0.01)、NF-κB(p65/p50)(P<0.05)、RBM15(P<0.05)mRNA表达水平上升,METTL3(P<0.05)、KIAA1429(P<0.05)mRNA表达水平均降低;Western blot结果显示,与对照组相比,ⅠκBα(P=0.171)、NF-κB/p65(P=0.191)、NF-κB/p50(P=0.063)、PAD4(P=0.687)、RBM15(P=0.176)、METTL3(P=0.430)、METTL14(P=0.089)、KIAA1429(P=0.238)蛋白表达水平差异均无统计学意义,WTAP蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl10蛋白表达水平降低(P<0.05)。RBM15 mRNA表达水平与CitH3(r=0.631,P=0.011)水平呈正相关性,与MPO(r=0.318,P=0.114)及NE(r=0.099,P=0.410)水平无相关性。结论RBM15、NETs在脓毒症心肌损伤中表达上调,且RBM15与NETs相关分子CitH3具有正相关性,RBM15可能通过调节NETs相关分子参与脓毒症心肌损伤。 展开更多
关键词 脓毒症心肌损伤 中性粒细胞胞外诱捕网 RNA结合基序蛋白15
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基于LTQ-Orbitrap液相色谱-质谱联用技术的乳源乳清蛋白组分的差异性研究 被引量:5
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作者 徐明芳 戴金凤 +4 位作者 向明霞 成希飞 曾晓琮 万丛庆 周卫军 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2014年第4期501-506,共6页
利用LTQ Orbitrap XL组合型傅立叶变换高分辨质谱系统分析了乳源蛋白主要组分肽指纹图谱。对南方水牛乳与不同来源的乳清蛋白的氨基酸序列研究结果表明,乳清蛋白经酶解后主要为α-乳白蛋白(α-La)和β-乳球蛋白(β-Lg)组分,乳清蛋白肽... 利用LTQ Orbitrap XL组合型傅立叶变换高分辨质谱系统分析了乳源蛋白主要组分肽指纹图谱。对南方水牛乳与不同来源的乳清蛋白的氨基酸序列研究结果表明,乳清蛋白经酶解后主要为α-乳白蛋白(α-La)和β-乳球蛋白(β-Lg)组分,乳清蛋白肽质指纹谱的分析显示水牛乳与荷斯坦奶乳清蛋白α-La氨基酸发生变异的比率明显少于山羊奶乳清蛋白α-La,说明荷斯坦奶α-La和水牛乳α-La的差异更小,同源性更强;而水牛乳β-Lg与荷斯坦乳β-Lg氨基酸发生变异的部位比率要多于山羊奶,水牛乳β-Lg与山羊奶同源性更强;乳源酪蛋白酶解后的肽段主要组分为αs1-CN,β-CN,κ-N,通过对水牛乳酪蛋白的氨基酸序列的差异性分析,不同品种的乳源酪蛋白的氨基酸序列明显存在差异。与乳清蛋白相比,奶牛品种差异导致乳蛋白发生氨基酸差异现象更显著,酪蛋白的氨基酸序列对比表明,水牛奶酪蛋白与山羊奶酪蛋白比与乳牛酪蛋白的差异更大。 展开更多
关键词 LTQ Orbitrap质谱 乳源蛋白 酪蛋白 乳清蛋白 肽质指纹谱 差异性
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scFv-DEC205-Trap重组包涵体靶向抗原复性及过程的优化
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作者 佟春玉 张喆林 +4 位作者 王森 郑小会 韩玉芳 崔玉东 宋博翠 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第15期1866-1871,共6页
目的:疫苗防治将成为金黄色葡萄球菌防控的主要方式,如何解决靶向亚单位疫苗生产中包涵体靶向抗原的复性问题,将是蛋白亚单位疫苗生产的核心问题。方法:构建靶向树突状细胞DEC205受体的金黄色葡萄球菌重组scFv-DEC205-Trap质粒进行PCR... 目的:疫苗防治将成为金黄色葡萄球菌防控的主要方式,如何解决靶向亚单位疫苗生产中包涵体靶向抗原的复性问题,将是蛋白亚单位疫苗生产的核心问题。方法:构建靶向树突状细胞DEC205受体的金黄色葡萄球菌重组scFv-DEC205-Trap质粒进行PCR、测序鉴定,IPTG诱导表达。对表达后形成的包涵体各项溶解条件:溶液、溶解温度、溶解时间以及是否振荡进行单因素优化;对复性缓冲液的不同添加剂和稀释浓度进行条件优化,最大限度提高包涵体蛋白复性率,Western blot检测复性蛋白抗原性。结果:离心力大于400 g,离心3 min以上,96%的包涵体蛋白沉降;含8 mol/L的尿素溶液在4~40℃溶解0.5 h以上可使包涵体蛋白充分溶解;3 mol/L精氨酸的100 mmol/L Tris-HCl缓冲液稀释5倍复性率最高,抗原性好。结论:实验证明通过适宜的溶解条件和复性条件可以从表达包涵体中获得良好抗原性的重组靶向抗原。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌trap scFv-DEC205-trap重组抗原 变性 复性
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恶性疟原虫TRAP/CSP融合抗原的构建及表达
9
作者 杜景伶 潘卫庆 +1 位作者 钱锋 谢超 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期262-265,共4页
目的 构建恶性疟原虫红前期融合蛋白 4(PfCP 4)。 方法 通过甘氨酸 脯氨酸 甘氨酸 (GPG)接点将恶性疟原虫 3D7株血凝素相关匿名蛋白 (TRAP)膜外区序列 (氨基酸 2 6~ 3 3 0 )和环子孢子蛋白 (CSP) 19个 4肽重复区及其羧基末端序列 ... 目的 构建恶性疟原虫红前期融合蛋白 4(PfCP 4)。 方法 通过甘氨酸 脯氨酸 甘氨酸 (GPG)接点将恶性疟原虫 3D7株血凝素相关匿名蛋白 (TRAP)膜外区序列 (氨基酸 2 6~ 3 3 0 )和环子孢子蛋白 (CSP) 19个 4肽重复区及其羧基末端序列 (氨基酸 199~ 3 83 )连接 ,采用不对称PCR法人工合成 15 77bpPfCP 4基因。将PfCP 4基因克隆在pQE表达质粒上 ,转化大肠杆菌SG13 0 0 9后进行诱导表达 ,用抗CSP的免疫血清进行免疫印迹检测。 结果 免疫印迹检测显示在 5 7kDa处出现特异的表达条带 ,其大小与推算的PfCP 4分子量一致 ,表明PfCP 4合成基因能在大肠杆菌中表达分子量为 5 7kDa的PfCP 4重组蛋白。 结论 成功构建了PfCP 4。 展开更多
关键词 恶性疟原虫 融合蛋白 环子孢子蛋白 血凝素相关匿名蛋白 基因表达 疟疾 疟疾疫苗 抗原
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中性粒细胞胞外诱捕网通过CCDC25促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究
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作者 木特力·买买提 徐磊磊 +1 位作者 李文强 颜飞华 《医学分子生物学杂志》 CAS 2024年第2期129-134,共6页
目的探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制。方法纳入骨肉瘤患者和健康受试者各20例,通过ELISA检测血清中PAD4和H3cit水平。提取两组人群外周血中性粒细胞... 目的探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制。方法纳入骨肉瘤患者和健康受试者各20例,通过ELISA检测血清中PAD4和H3cit水平。提取两组人群外周血中性粒细胞,比较NETs形成差异。将NETs与骨肉瘤细胞MG63共孵育,期间加入DNA降解酶DNaseⅠ,分为对照组、NETs组和NETs+DNaseⅠ组。通过蛋白质印迹检测CCDC25蛋白表达水平,CCK8检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平。将si-NC和si-CCDC25转染至MG63,加入NETs共孵育,分为si-NC组和si-CCDC25组,通过蛋白质印迹检测CCDC25蛋白表达水平,CCK8检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平。结果与健康受试者比较,骨肉瘤患者血清中PAD4和H3cit水平升高(P<0.05),NETs形成能力增强。与对照组比较,NETs组CCDC25蛋白表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭水平升高(P<0.05)。与NETs组比较,NETs+DNaseⅠ组CCDC25蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CCDC25组CCDC25蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05)。结论NETs通过释放的DNA激活骨肉瘤细胞CCDC25表达,从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。 展开更多
关键词 中性粒细胞胞外诱捕网 骨肉瘤 脱氧核糖核酸酶Ⅰ 卷曲螺旋结构域蛋白25
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中性粒细胞胞外诱捕网、ANGPTL4及MIP-1α与急性呼吸窘迫综合征严重程度相关性及对临床转归的预测价值
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作者 尚苗苗 常志江 +2 位作者 李锦霞 南当当 郝丽云 《临床和实验医学杂志》 2024年第9期918-922,共5页
目的分析中性粒细胞胞外诱捕网(NET)、血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)及巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)严重程度相关性及对临床转归的预测价值。方法回顾性将2021年1月至2023年1月延安市人民医院治疗的102例ARDS... 目的分析中性粒细胞胞外诱捕网(NET)、血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)及巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)严重程度相关性及对临床转归的预测价值。方法回顾性将2021年1月至2023年1月延安市人民医院治疗的102例ARDS患者纳入观察组,其中重度ARDS患者42例,非重度ARDS患者60例;另选102名健康体检者纳入对照组。检测所有入选者血清NET的标志物游离DNA(cf-DNA/NET)、ANGPTL4、MIP-1α水平;分析cf-DNA/NET、ANGPTL4、MIP-1α与急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分、氧合指数的关系;采用受试者操作特征(ROC)曲线分析cf-DNA/NET、ANGPTL4、MIP-1α对ARDS患者病死的预测效能。结果观察组血清cf-DNA/NET、ANGPTL4、MIP-1α水平分别为(480.25±114.73)ng/mL、(1065.93±225.85)ng/mL、(125.98±36.81)pg/mL,均高于对照组[(136.82±24.57)ng/mL、(205.82±44.71)ng/mL、(52.43±12.74)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。重度ARDS患者血清cf-DNA/NET、ANGPTL4、MIP-1α水平分别为(541.64±130.05)ng/mL、(1358.19±289.80)ng/mL、(156.34±51.79)pg/mL,均高于非重度ARDS患者[(405.82±62.37)ng/mL、(863.92±187.43)ng/mL、(89.72±25.04)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。经Pearson相关性分析,ARDS患者血清cf-DNA/NET、ANGPTL4、MIP-1α水平均与APACHEⅡ评分呈正相关(P<0.05),与氧合指数呈负相关(P<0.05)。经多因素Logistic回归分析,ARDS患者血清cf-DNA/NET、ANGPTL4、MIP-1α均是其病死的独立预测因素(P<0.05)。经ROC曲线分析,血清cf-DNA/NET、ANGPTL4联合MIP-1α预测ARDS患者病死的AUC为0.928。结论血清cf-DNA/NET、ANGPTL4及MIP-1α均在ARDS患者外周血中呈高表达,均与其病情严重程度有关,联合应用可提高对患者病死的预测效能。 展开更多
关键词 急性呼吸窘迫综合征 中性粒细胞胞外诱捕网 血管生成素样蛋白4 巨噬细胞炎性蛋白1Α 严重程度 临床转归
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中性粒细胞胞外诱捕网在儿童重症肺炎支原体肺炎中的意义
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作者 董庆华 尹建运 +2 位作者 苏杭 黄莉 倪倩 《新医学》 CAS 2024年第7期520-526,共7页
目的探讨中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在儿童重症肺炎支原体肺炎(SMPP)发生、发展中的作用,并评价其对SMPP的预测价值。方法选择2023年10月至12月兰州大学第二医院收住院的肺炎支原体肺炎(MPP)患儿为研究对象,分为非重症组(MPP组,n=45例... 目的探讨中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在儿童重症肺炎支原体肺炎(SMPP)发生、发展中的作用,并评价其对SMPP的预测价值。方法选择2023年10月至12月兰州大学第二医院收住院的肺炎支原体肺炎(MPP)患儿为研究对象,分为非重症组(MPP组,n=45例)和重症组(SMPP组,n=39)。采用ELISA检测2组患儿血清中NETs质量浓度。分别收集SMPP组患儿的患侧肺及健侧肺肺泡灌洗液(BALF),采用ELISA检测BALF中NETs质量浓度。结果MPP与SMPP患儿血清中NETs质量浓度比较差异有统计学意义(P<0.01)。SMPP组患侧肺BALF中的NETs质量浓度高于健侧肺(P<0.001)。SMPP组血清中NETs质量浓度高于BALF(P<0.001)。血清中NETs质量浓度预测SMPP的受试者操作特征曲线下面积(ROC AUC)为0.892(95%CI 0.810~0.963,P<0.001),灵敏度为0.821,特异度为0.875,截断值为17.24 ng/mL;血清中NETs联合C-反应蛋白(CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)预测SMPP的ROC AUC为0.974(95%CI 0.946~1.000,P<0.001),灵敏度为0.923,特异度为0.950。结论MPP患儿中过度激活的NETs可能与SMPP的发生及SMPP的局部肺损伤有关。检测MPP患儿血清中NETs、CRP、LDH水平可有效预测SMPP,其中以联合预测的效能最优。 展开更多
关键词 儿童 中性粒细胞胞外诱捕网 重症肺炎支原体肺炎 肺泡灌洗液 C-反应蛋白 乳酸脱氢酶
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利用GFP-Trap和酵母双杂交技术筛选TaPR1互作靶标 被引量:1
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作者 申松松 王菲 +3 位作者 耿怀民 孟麟硕 冯燕 王海燕 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期64-70,112,共8页
病程相关蛋白PR1(pathogenesis related PR1 proteins,PR1)在小麦抗病防御反应中发挥重要作用。本试验是在前期研究基础上,借助烟草成功表达TaPR1蛋白,利用GFP-Trap技术结合质谱分析获得与TaPR1互作的蛋白。同时,利用酵母双杂交技术(Yea... 病程相关蛋白PR1(pathogenesis related PR1 proteins,PR1)在小麦抗病防御反应中发挥重要作用。本试验是在前期研究基础上,借助烟草成功表达TaPR1蛋白,利用GFP-Trap技术结合质谱分析获得与TaPR1互作的蛋白。同时,利用酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid,Y2H)在接种叶锈菌生理小种PHNT的‘中国春’小麦酵母文库中筛选获得与TaPR1互作的寄主蛋白。经过序列比对分析,2种方法共同筛选出谷氨酰氨合成酶(Glutamine synthetase)、细胞色素b6(Cytochrome b6)、应激蛋白(Stress protein)等可能与TaPR1互作的蛋白,为进一步深入研究TaPR1参与小麦叶锈病防御反应的分子机制提供了理论基础。 展开更多
关键词 小麦叶锈菌 病程相关蛋白PR1 GFP-trap 酵母双杂交 互作蛋白
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Trap抗原诱导细胞免疫对S.aureus免疫保护作用的研究
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作者 韩先乐 张喆林 +7 位作者 申雪 王蓝悦 王森 刘骓 马鑫月 崔玉东 宋博翠 佟春玉 《黑龙江八一农垦大学学报》 2022年第1期79-86,共8页
金黄色葡萄球菌(S.aureus)是奶牛乳房炎的主要致病菌。实验利用S.aureus的Trap基因构建Trap/PET-32a表达质粒,IPTG诱导表达后柱层析纯化Trap蛋白,与弗氏佐剂混合制备疫苗,小鼠肌肉免疫,二免后7 d,分离小鼠脾细胞,经Trap抗原刺激后检测... 金黄色葡萄球菌(S.aureus)是奶牛乳房炎的主要致病菌。实验利用S.aureus的Trap基因构建Trap/PET-32a表达质粒,IPTG诱导表达后柱层析纯化Trap蛋白,与弗氏佐剂混合制备疫苗,小鼠肌肉免疫,二免后7 d,分离小鼠脾细胞,经Trap抗原刺激后检测细胞因子,二免后14 d,小鼠眼球采血制备血清检测抗体,小鼠腹腔S.aureus Newman株攻毒2 d后,取小鼠的肝、脾、肺、肾,涂板检测细菌荷载量,攻毒7 d后制作病理组织切片。结果显示Trap蛋白免疫组比标签蛋白PET-32a对照组极显著增强了细胞因子IFN-γ,IL-4和IL-17A的表达水平与特异性IgG的表达水平;显著降低了细菌对小鼠各个器官的损伤与定植,攻毒保护保护率为56%。实验验证了S.aureus的Trap抗原小鼠免疫既增强了体液免疫又提高了细胞免疫水平,对小鼠有理想的免疫保护作用。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 疫苗 免疫保护 trap蛋白 细胞免疫
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Promoter trapping in Magnaporthe grisea
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作者 刘小红 卢建平 +2 位作者 王教瑜 闵航 林福呈 《Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology)》 SCIE CAS CSCD 2006年第1期28-33,共6页
Application of promoter trapping based on transformation in Magnaporthe grisea is reported in this paper. Two promoter-trapping vectors, designated as pCBGFP and pEGFPHPH, were constructed and transformed into protopl... Application of promoter trapping based on transformation in Magnaporthe grisea is reported in this paper. Two promoter-trapping vectors, designated as pCBGFP and pEGFPHPH, were constructed and transformed into protoplasts of M. grisea. A library of 1077 transformants resistant to hygromycin B was generated. Of which, 448 transformants were found to express eGFP gene in different structures of M. grisea. Three transformants grew slowly, 5 transformants decreased in conidiation and 7 transformants reduced in pathogenicity greatly among these 448 transformants. Eleven transformants were checked by genomic southern blot randomly, and 9 of which were single-copy insertions. The promoter trapping technique has been applied successfully in M. grisea and can be used as a tool for functional genomic analysis. 展开更多
关键词 Promoter trapping Green fluorescent protein Magnaporthe grisea
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纳升液相色谱-静电场轨道阱质谱法检测鹅膏菌属毒性相关内源性前体蛋白
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作者 王希希 白玉 +3 位作者 李鹏昊 李晓辉 高舸 王炼 《食品安全质量检测学报》 CAS 北大核心 2023年第21期147-156,共10页
目的建立纳升液相色谱-静电场轨道阱质谱法测定鹅膏菌属中MSDIN毒性相关前体蛋白的方法。方法样品经纯水提取、超滤分离后,采用StageTips C18进行样品除盐;以0.1%甲酸水溶液和含0.1%甲酸的乙腈/水(4:1,V:V)溶液为流动相,采用梯度洗脱方... 目的建立纳升液相色谱-静电场轨道阱质谱法测定鹅膏菌属中MSDIN毒性相关前体蛋白的方法。方法样品经纯水提取、超滤分离后,采用StageTips C18进行样品除盐;以0.1%甲酸水溶液和含0.1%甲酸的乙腈/水(4:1,V:V)溶液为流动相,采用梯度洗脱方式,经AcclaimTMPepMapTM100 C18(70 mm×75μm,3μm)预富集,AcclaimTMPepMapTM100 C18(150 mm×75μm,3μm)分离,采用电喷雾离子源正离子模式测定,Protein Discover软件对蛋白质进行鉴定;分别对蛋白提取液种类、蛋白质纯化方法和蛋白酶种类进行对比和优化。结果优化前处理条件后选择纯水作为提取溶剂,提取液经Vivaspin Turbo 4(3 kDa)分离纯化和StageTips C18除盐后,样品在非酶解状态下进行分析;将本方法用于2017—2020年四川地区食物中毒事件中收集到的23株鹅膏菌属类蘑菇,共鉴定MSDIN毒性相关内源性前体蛋白50个;与市售8种可食用蘑菇比较,差异表达前体蛋白41个,其中13条前体蛋白为全部23株鹅膏菌属类蘑菇共有,可作为鹅膏菌属潜在的特征性靶标分子。结论该方法简单快速、特异性强,可作为形态学鉴定、DNA测序和毒素检测的补充方法,初步用于鹅膏菌属的快速识别。 展开更多
关键词 纳升液相色谱-静电场轨道阱质谱法 MSDIN毒性相关内源性前体蛋白 鹅膏菌属
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基于中性粒细胞胞外诱捕网探究丹参酮ⅡA对脓毒症小鼠肠损伤的影响及机制 被引量:5
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作者 陈聪敏 张晓慧 +3 位作者 丁新耘 马源 刘澈 马玉清 《中国急救医学》 CAS CSCD 2023年第2期119-125,共7页
目的探究丹参酮ⅡA(TanⅡA)对脓毒症小鼠肠损伤的影响和中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在其中的作用及可能机制。方法24只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(Control组)、脂多糖组(LPS组)、LY294002组(LPS+LY组)、丹参酮ⅡA组(LPS+TanⅡA... 目的探究丹参酮ⅡA(TanⅡA)对脓毒症小鼠肠损伤的影响和中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在其中的作用及可能机制。方法24只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(Control组)、脂多糖组(LPS组)、LY294002组(LPS+LY组)、丹参酮ⅡA组(LPS+TanⅡA组),每组6只。除Control组注射等量磷酸盐缓冲液(PBS)外,其余各组腹腔注射LPS 10 mg/kg建立脓毒症模型。LPS+LY组于造模前30 min腹腔注射LY29400230 mg/kg,LPS+TanⅡA组于造模前30 min腹腔注射TanⅡA 30 mg/kg,其余两组于上述时间点腹腔注射等量PBS[含1‰二甲基亚砜(DMSO)]。给药12 h后采集标本。苏木精-伊红(HE)染色观察小肠组织病理学变化并进行Chiu′s评分;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清D-乳酸(D-Lac)水平、小肠组织髓过氧化物酶(MPO)-DNA复合物(MPO-DNA)及瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)含量;蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测小肠组织闭合蛋白(Claudin)-1、磷酸化(p-)PI3K、磷酸化(p-)Akt蛋白表达。结果与Control组比较,LPS组小鼠小肠组织病理损伤严重;Chiu′s评分升高;血清D-Lac水平上升,小肠组织MPO-DNA、CitH3含量增加Claudin-1蛋白表达减少,p-PI3K、p-Akt蛋白表达增加,差异均有统计学意义(P<0.001)。与LPS组比较,LPS+LY组和LPS+TanⅡA组小鼠小肠组织病理损伤减轻,Chiu′s评分降低(P<0.001),血清D-Lac水平下降(P<0.001),小肠组织MPO-DNA、CitH3含量减少(P<0.001);Claudin-1蛋白表达增加(P<0.05或P<0.001),p-PI3K、p-Akt蛋白表达减少(P<0.01)。结论TanⅡA通过抑制PI3K/Akt信号通路,减少NETs生成,增加Claudin-1蛋白表达,降低肠黏膜通透性,发挥脓毒症小鼠肠损伤的保护作用。 展开更多
关键词 脓毒症 肠损伤 中性粒细胞胞外诱捕网(NETs) 磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt) 丹参酮ⅡA(TanⅡA) 瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3) 闭合蛋白-1(Claudin-1)
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尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化与血清高迁移率族蛋白B1、中性粒细胞胞外诱捕网的关系 被引量:1
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作者 胡海峰 张弦 王水俐 《安徽医药》 CAS 2023年第3期571-575,共5页
目的 探讨尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化与血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)表达水平的关系。方法 选取2019年1月至2020年1月上海杨思医院收治的225例尿毒症血液透析病人为研究对象,根据是否并发动脉粥... 目的 探讨尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化与血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)表达水平的关系。方法 选取2019年1月至2020年1月上海杨思医院收治的225例尿毒症血液透析病人为研究对象,根据是否并发动脉粥样硬化将其分为非动脉粥样硬化组119例、动脉粥样硬化组106例。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清HMGB1水平,采用荧光染色法检测血清NETs水平,采用彩色多普勒超声诊断仪检测内膜中层厚度(IMT),采用全自动生化分析仪检测生化指标钙、磷、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,并计算钙磷乘积;分析尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化病人血清HMGB1、NETs与IMT及生化指标的相关性;分析影响尿毒症血液透析病人动脉粥样硬化发生的因素。结果 动脉粥样硬化组HMGB1[(8.94±2.33)μg/L比(6.21±1.16)μg/L]、NETs[(416.82±45.61)μg/L比(194.58±20.23)μg/L]、IMT、三酰甘油、总胆固醇、LDL-C水平及年龄高于非动脉粥样硬化组,HDL-C水平低于非动脉粥样硬化组(P<0.05)。尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化病人血清HMGB1与NETs呈正相关(r=0.54,P<0.001);尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化病人血清HMGB1、NETs与IMT、三酰甘油、总胆固醇、LDL-C呈正相关,与HDL-C呈负相关(P<0.05)。HMGB1、NETs是影响尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化的独立危险因素(P<0.05)。结论 并发动脉粥样硬化的尿毒症血液透析病人血清HMGB1、NETs表达水平升高,二者对预测尿毒症血液透析病人动脉粥样硬化有重要意义。 展开更多
关键词 尿毒症 血液透析 高迁移率族蛋白B1 中性粒细胞胞外诱捕网 动脉粥样硬化
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亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱测定蛋白食品中L-羟脯氨酸残留 被引量:14
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作者 赵善贞 邓晓军 +5 位作者 彭涛 伊雄海 郭德华 韩丽 盛永刚 吴巧彬 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1373-1379,共7页
建立了亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱检测含蛋白食品中的皮革水解蛋白标示物L-羟脯氨酸(L-HYP)的同时定性与定量分析方法。样品中的L-HYP经酶解后用乙腈沉淀蛋白,HLB小柱除去部分脂溶性干扰物,采用液相色谱-质谱进行测... 建立了亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱检测含蛋白食品中的皮革水解蛋白标示物L-羟脯氨酸(L-HYP)的同时定性与定量分析方法。样品中的L-HYP经酶解后用乙腈沉淀蛋白,HLB小柱除去部分脂溶性干扰物,采用液相色谱-质谱进行测定。本方法采用IDA结合EPI模式对试样中的L-HYP进行定性分析,并建立L-HYP的二级子离子谱库。通过以MRM模式对L-HYP进行定量分析,L-HYP在12种蛋白食品中平均回收率在73.4%~114.2%(n=6)之间,相对标准偏差在2.5%~14.4%(n=6)之间,可对试样中的L-HYP在定性确证的同时进行定量分析。 展开更多
关键词 L-羟脯氨酸 亲水性相互作用色谱 四极杆串联线性离子阱质谱 皮革水解蛋白
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ncRNA候选基因spt1的克隆与初步分析 被引量:4
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作者 孙强 黄红艳 韩骅 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第5期485-488,共4页
在用suc2信号肽捕获系统对小鼠胚胎cDNA文库筛选的过程中 ,反复获得一个相同的强阳性克隆 ,命名为spt1。对该克隆的序列分析表明 :插入序列由 6 97bp组成 ,6个开放阅读框中共有 37个启始密码子 (ATG)和 80个终止密码子 (TGA、TAG、TAA) ... 在用suc2信号肽捕获系统对小鼠胚胎cDNA文库筛选的过程中 ,反复获得一个相同的强阳性克隆 ,命名为spt1。对该克隆的序列分析表明 :插入序列由 6 97bp组成 ,6个开放阅读框中共有 37个启始密码子 (ATG)和 80个终止密码子 (TGA、TAG、TAA) ;没有较大的有意义开放读框存在。经BLAST分析 ,结果显示该序列定位于小鼠第17号染色体长臂 ,没有发现同源基因。Northernblot和RT PCR分析表明 ,该序列仅表达于小鼠卵巢组织 ,全长约4 5~ 5 0kb。酵母转化和序列截短实验提示 ,该序列能够介导蔗糖转换酶向细胞外的分泌。因此 ,推测spt1很有可能是一个新的非编码RNA的一部分 ,参与蛋白质的分泌过程。 展开更多
关键词 suc2信号肽捕获系统 非编码RNA 蛋白质分泌
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