Association of TSHR gene intron 1 and 4p14 single-nucleotide polymorphisms and gene-gene interactions with Graves' disease

Objective To identify the association of thyroid stimulating hormone receptor(TSHR)gene intron 1 susceptible loci and 4p14 susceptible locus rs6832151 polymorphisms with Graves’disease(GD)in Han Chinese population in Bengbu,Anhui,China.The gene-gene interaction among TSHR intron 1 susceptible loci and 4p14susceptible locus rs6832151 was also investigated.Methods The genotypes of the single-nucleotide polymor-

绵羊TSHR基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系

为了探究绵羊TSHR基因表达及其多态性与季节性发情之间的关系,本试验采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)研究TSHR基因在常年发情小尾寒羊和季节性发情苏尼特羊的大脑、下丘脑和垂体组织中的表达情况,比较两个绵羊品种的3种组织中TSHR基因的表达差异。同时利用SequenomMassARRAY○R SNP技术检测2组绵羊(常年发情组:小尾寒羊、策勒黑羊和湖羊;季节性发情组:滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)TSHR基因SNP位点(g.89290286A>G和g.89355312G>A)的多态性,并与绵羊季节性发情性状进行关联分析。结果表明,无论在小尾寒羊还是苏尼特羊中TSHR基因下丘脑中表达量均极显著高于大脑和垂体(P<0.01),且苏尼特羊下丘脑中TSHR基因表达量极显著高于小尾寒羊(P<0.01)。绵羊TSHR基因g.89290286A>G和g.89355312G>A位点均存在AA、GA和GG共3种基因型,其中g.89290286A>G位点在小尾寒羊、策勒黑羊和草原型藏羊中表现为中度多态(0.25<PIC<0.5),在滩羊、湖羊和苏尼特羊中表现为低度多态(PIC<0.25),g.89355312G>A位点在6个绵羊品种中表现为中度多态(0.25<PIC<0.5)。TSHR基因上述2个位点的基因型频率在常年发情和季节性发情绵羊品种间差异均达到极显著水平(P<0.01)。综上,TSHR基因的表达可能与绵羊季节性发情有关,其g.89290286A>G和g.89355312G>A位点与绵羊季节性发情性状可能存在一定关联。

TSHR基因上新发现SNP及其在GD致病中的评价

目的探讨TSH受体上单核苷酸多态性(SNP)与Graves病(GD)的相关性。方法(1)以一GD家系的12个成员(包括3例患者、9例家系成员)为研究对象,抽提外周血DNA,设计引物,扩增TSHR的全部外显子和部分内含子,PCR产物纯化后测序,对TSH受体的SNP进行筛查。(2)应用病例-对照研究方法,检测筛查出的SNP基因型和等位基因变化频率与GD有无相关性。结果共发现8个多态位点,其中第8外显子上的多态位点在SNP库中未见报道,为首次发现。这些多态位点的变化频率在患者与正常组间相比较,无明显统计学差异。结论新发现的SNP及其他多态位点与GD不连锁;提示汉族人TSH受体基因与GD无相关性;该基因的多态位点在不同的人种间存在明显差异。

pcDNA3.1/hTSHRa重组体的构建

目的:构建重组体pcDNA3.1/hTSHRa。方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果:PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRa。该片段与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHRa片段插入序列和方向正确。结论:hTSHRa片段插入真核表达载体pcDNA3.1TOPO,插入序列和插入方向正确,可用于后续基因表达。

甲状腺乳头状癌组织中TSHR基因启动子甲基化研究

目的探讨甲状腺乳头状癌组织中促甲状腺激素受体基因(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)基因启动子区5′端CpE岛甲基化改变的特点与临床特征的关系。方法采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法检测TSHR基因启动子甲基化情况。结果 (1)甲状腺乳头状癌组织中TSHR基因启动子甲基化的发生率为64.7%(22/34),癌旁组织中TSHR基因启动子甲基化的发生率为26.5%(9/34),癌组织中TSHR基因启动子甲基化率显著高于癌旁组织(P<0.05)。(2)有淋巴结转移的甲状腺乳头状癌组织TSHR基因启动子甲基化的发生率为83.3%(15/18),高于无淋巴结转移组43.8%(7/16)(P<0.05)。结论 TSHR基因启动子异常甲基化是甲状腺乳头状癌发展过程中的分子事件之一,可能影响了甲状腺乳头状癌细胞的摄碘的功能。

绵羊TSHR基因多态性及其与繁殖性状关联分析

为探讨TSHR基因多态性与绵羊季节性繁殖和产羔数的关系,本实验采用Sequenom Mass-ARRAY?SNP分型技术检测常年发情的小尾寒羊(407只)、湖羊(101只)、策勒黑羊(48只)和季节性发情的苏尼特羊(21只)、滩羊(22只)、草原型藏羊(161只)TSHR基因的单核苷酸多态性(SNP)位点,并进行群体遗传学分析及其与小尾寒羊产羔数的关联分析。结果表明:TSHR基因g.89430525G>A、g.89363881T>C和g.89431097C>G的基因型频率和等位基因频率在常年发情绵羊品种和季节性发情绵羊品种间差异极显著(P<0.01);这3个SNP位点在大多数绵羊品种中表现为中度多态,且在各个绵羊品种中处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05);TSHR基因g.89431097C>G位点的多态性与小尾寒羊第1～3胎的产羔数显著相关(P<0.05),其中CC型母羊的产羔数显著低于CG和GG型母羊(P<0.05)。本研究表明,TSHR基因与绵羊季节性繁殖性状具有较强的相关性,同时参与绵羊季节性繁殖和多羔性状的调控。

先天性甲状腺功能减退症壮族患儿TSHR基因突变遗传分析

目的分析南宁市先天性甲状腺功能减退症壮族患儿促甲状腺激素受体(TSHR)基因突变及其特点。方法以21例患有先天性甲状腺功能减退症的壮族患儿及其父母为研究对象。提取患儿及其父母的外周血DNA,采用荧光定量PCR扩增TSHR基因所有12个外显子、外显子-内含子交界区以及3′端和5′端非翻译区,利用第一代测序法对基因扩增产物进行测序并进行分析。结果21例患儿中的12例存在TSHR基因突变,分别为c.C805A(p.R269S)纯合突变6例,c.C154A(p.P52T)和c.C805A(p.R269S)复合杂合突变1例,c.C805A(p.R269S)杂合子复合c.G2181C(p.E727D)纯合突变1例,c.C805A(p.R269S)杂合子突变4例。40例父母中存在的TSHR位点基因突变分别为c.C154A(p.P52T)1例,c.G2181C(p.E727D)9例,c.C805A(p.R269S)24例。结论先天性甲状腺功能减退症患儿的发病与父母TSHR基因具有遗传相关性,新发现的c.C805A(p.R269S)基因突变位点可能是壮族人群遗传性先天性甲状腺功能减退症的主要突变位点。

非自身免疫性甲状腺功能亢进症1例临床和基因变异分析

目的分析非自身免疫性甲状腺功能亢进症的临床及遗传学特征。方法回顾分析1例非自身免疫性甲状腺功能亢进症患儿的临床资料和基因检测结果。结果患儿,男,9月龄,以心率增快为主要表现,合并全面性发育迟缓、先天性心脏病等。实验室检测提示促甲状腺激素降低,游离三碘甲状腺原氨酸及游离甲状腺素均升高,相关抗体检查全部阴性。基因检测发现TSHR基因第10外显子c.1894A>G(p.T 632A)的错义变异,为新发变异,尚未见报道,经软件预测为致病性变异。予患儿甲巯咪唑口服治疗,甲状腺功能明显好转,发育落后改善。结论基因检测有利于非自身免疫性甲状腺功能亢进症的诊断。

可诱导共刺激分子配体上调Graves病动物免疫应答

目的：研究可诱导共刺激分子及配体（ICOS／ICOSL）在Graves 病（以下简称甲亢，GD）中的病理生理机制。方法：45只远交系BALB／c 小鼠随机分成三组各15只，用基因枪将不同质粒注射。A 组采用表达pCDNA3．0－mICOSL 和pCDNA3．0－hTSHR 的质粒免疫；B 组用表达pCDNA3．0－hTSHR 的质粒免疫，C 组采用空质粒pcDNA3．0免疫作为对照组。放免法测定小鼠血清游离甲状腺素（FT4）、脾脏细胞上清液IFN－γ度，ELISA 法血清促甲状腺素受体抗体（TRAb），小鼠血清和转染人hTSHR－CHO 细胞共同孵育后检测cAMP 浓度判断TRAb 自身抗体活性。结果：质粒注射后A 组小鼠血清FT4水平（0．49±0．25）pg／ml 高于C 组（q＝6．571，P ＝0．023）；成模达标率（10／15例）高于B、C 两组（χ2＝14．47，P ＝0．005）。A 组小鼠脾脏原代培养上清液IFN－γ的产量（1．88±0．41）pmol／L 明显高于B、C 两组（F ＝17．85，P ＝0．003）。A 组小鼠血清TRAb 活性188．3（179．7～260．2）％高于B、C 组（P ＝0．027）。结论：外源性导入pCDNA3．0－mICOSL 到GD 小鼠，能刺激其脾脏淋巴细胞分泌IFN－γ，增加自身抗体TRAb 活性，从而上调GD 动物体内免疫应答。

乳头状甲状腺癌促甲状腺激素受体第十外显子基因突变研究

目的 研究乳头状甲状腺癌发病是否与促甲状腺激素受体 (TSHR)第十外显子基因突变有关。方法 采用NEST-PCR-SSCP(巢氏多聚酶联反应 -单链构象多态性分析 )方法及DNA测序方法,对 65例乳头状甲状腺癌和 44例对照组织TSHR第十外显子基因进行检测。结果 经NEST-PCR-SSCP检测,65例乳头状甲状腺癌TSHR第十外显子未发现明显带型异常,第三片段取 2例对照组织和 3例甲状腺癌组织进行DNA测序, 5例组织TSHR2000位点碱基均由C→T,使得所编码的 601位氨基酸由组氨酸 (CAT)→酪氨酸(TAT) (His→Tyr),余无明显基因突变。结论 乳头状甲状腺癌TSHR第十外显子未发现基因突变,提示乳头状甲状腺癌发病与TSHR第十外显子基因突变无关;由于所测 5例标本 601位氨基酸均为酪氨酸,考虑中国人TSHR基因与国外人群存在差异。

甲状腺乳头状癌中hMLH1、NIS和TSHR基因异常甲基化的相互关系及临床意义

目的:探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织中错配修复酶人类mutL同系物1(humanmutL homologue1,hMLH1)基因的异常甲基化状态,及其与钠碘同向转运体(sodium iodide symporter,NIS)、甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)基因异常甲基化的相互关系。方法:采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应分别检测152例PTC及对应癌旁正常组织中hMLH1、NIS和TSHR基因启动子甲基化状况。分析hMLH1基因甲基化与各临床病理特征参数之间的关系;hMLH1、NIS和TSHR基因甲基化之间的相关性;以及三者独立、协同作用对PTC进展的影响。结果:152例PTC组织中hMLH1基因的甲基化阳性率(37.5%)高于癌旁正常组织(5.3%)(P<0.05)。hMLH1甲基化与原发灶大小、数量、局部侵犯、T分期、淋巴转移有关(P值均<0.05),而与性别、年龄、病理分期、远处转移无关。hMLH1、NIS和TSHR基因异常甲基化之间存在较弱相关性(r均<0.400);三者的协同作用对PTC各临床病例参数亦无显著影响(P值均>0.05)。结论:hMLH1基因的异常甲基化存在于PTC组织中,可能与肿瘤的进展有关;hMLH1、NIS和TSHR基因的异常甲基化之间不存在相关性,并且它们的独立、协同效应与PTC进展亦不存在相关性。

TSHR内含子1区段与4p14区段单核苷酸多态性及基因交互作用与Graves病相关性研究

目的探讨中国安徽蚌埠地区汉族人群促甲状腺素受体（TSHR）基因内含子1区段各单核苷酸多态性（SNP）位点（rs12101261、rs4903964、rs179247、rs2284722、rs17111394和rs2300525）、4p14区段SNP位点rs6832151与Graves病的关系以及TSHR内含子1区段各SNP位点与4p14区段SNP位点rs6832151之间基因．基因交互作用。方法用TaqMan探针技术，在FluidigmEP1平台上对611例Graves病患者和555名健康对照者的TSHR内含子1区段SNP位点、rs6832151位点进行等位基因分型、相关性分析、连锁分析、单体型分析及交互作用分析。结果TSHR基因内含子1区域的5个位点（rs12101261、rs4903964、rs179247、rs2284722、rs17111394）和4p14位点rs6832151与蚌埠地区汉族人群Graves病发病相关（均P〈0．05）。单体型分析显示，TSHR内含子1区段的rs179247、rs2284722、rs12101261、rs4903964四个SNP位点组成的AGTA、GGCG、AATA单体型及rs2300525、rs17111394组成的cc单体型频率分布在2组之间差异有统计学意义（均P〈0．01）。TSHR基因rs179247与rs12101261之间存在交互作用（P=0．001）；rs179247（TSHR基因）、rs4903964（TSHR基因）、rs6832151（4p14基因）三者之间存在交互作用（P=0．001）。结论TSHR内含子1区段基因多态性及单体型、4p14区段基因多态性与蚌埠地区汉族人群Graves病相关。TSHR、4p14两基因的单核苷酸多态性存在交互作用，这种作用使得Graves病的发病风险发生改变。

甲状腺乳头状癌组织中TSHR基因启动子甲基化及其临床意义

[目的]探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)组织中TSHR基因启动子区甲基化程度及其临床意义。[方法]采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-Specific Polymerase chain reaction,MSP)法检测100例PTC组织及其癌旁组织中TSHR基因启动子甲基化状态,并结合患者的临床病理特征和随访信息分析TSHR与PTC进展及预后的关系。[结果]100例PTC组织中TSHR基因启动子甲基化率为77%,明显高于癌旁组织的7%(P=0.002)。TSHR基因甲基化程度与患者初诊年龄、原发灶大小、数量、腺外侵犯、淋巴转移、TNM分期呈正相关(P<0.05);而与患者性别、T分期无关(P>0.05)。单因素生存分析显示TSHR基因甲基化预示更短的无病生存时间,而多因素生存分析显示TSHR基因甲基化不是PTC患者无病生存的独立影响因素。[结论 ]TSHR基因启动子区甲基化是PTC组织中频发的分子事件,与肿瘤的进展相关并提示PTC患者的不良预后。

TSHR基因内含子1区域多态性与Graves病的关联研究

目的探讨中国江苏徐州地区汉族人群促甲状腺素受体（TSHR）基因内含子1上单核苷酸多态性位点（SNP）rs179247和rs12101261与Graves病的关系。方法应用TaqMan探针技术，在FluidigmEPl平台上对1066例Graves病患者和1107名健康对照者进行基因分型；同时检测样本血清甲状腺激素和TSH受体抗体（TRAb）水平。结果rs179247-A、rs12101261-T与Graves病易感性关联（分别为OR=1．35，95％C／1．19～1．54，JP=5．92x10-：OR=1．32，95％C／1．16～1．50，P=2．22×10^-5）；Logistic回归提示rs179247是独rL的易感位点。在rs179247_GG、AG、AA3种基因型之间相比，血清TRAb水平具有统计学差异（P=0．015）；其他临床表现其差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论TSHR基因内含子1区域rs179247、rs12101261与徐州地区汉族人群Graves病相关联，并且rs179247是一个独立易感位点；该多态性与血清TRAb水平有关，与血清甲状腺激素水平、发病年龄、甲状腺肿大程度、Graves病眼征分级、复发与否无明显关联。、

TSHR基因内含子1区域多态性及其与Graves病的关系

目的探讨中国安徽蚌埠地区汉族人群Graves病患者促甲状腺激素受体（TSHR）基因内含子1上单核苷酸多态性位点（SNP）rsl79247、rsl2101261、rs2284722、rs4903964、rs2300525、rsl7111394与Graves病的关系。方法用TaqMan探针技术，在FluidigmEPl平台上对618例Graves病患者和646名健康对照者进行等位基因分型；同时对Graves病患者检测促甲状腺激素受体抗体（TRAb）水平。结果在6个分析的SNP位点中，除rs2300525外，余5个SNPs均与Graves病易感性关联，以rsl79247-G，rsl2101261-C，rs4903964-G与Graves病相关性最显著（P=2．85x10-10，OR=1．73，95％C／1．46～2．05；P=1．74×10-10，OR=1．73，95％C／1．46～2．05；P=2．24×10-10，OR=1．69，95％C／1．44～1．99）；logistic回归提示rs12101261和rs4903964是TSHR基因内含子1上的主效易感位点。rsl79247-G，rsl2101261-C及rs4903964-G与TRAb阳性Graves病患者显著关联（P=4．24×10-13=5．48×10-13，P=3．89×10-12）。结论TSHR基因内含子1区域rs179247、rs12101261、rs4903964与蚌埠地区汉族人群Graves病明显相关联；并且rs12101261和rs4903964是TSHR基因内含子1上的主效易感位点；TSHR基因可能是TRAb持续阳性Graves病患者的一个主效易感基因。

甲状腺功能亢进症儿童促甲状腺素受体基因突变分析

目的探讨中国广州地区甲状腺功能亢进症(甲亢)患儿促甲状腺素受体(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR)基因突变特点。方法2009年7月~2014年7月在我院诊断为甲亢的患儿90例,男28例,女62例,诊断年龄(7.5±3.4)岁。提取患儿的外周血基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段并直接测序,对患儿的TSHR基因第10外显子进行突变检测分析,50例健康儿童作为正常对照。探讨TSHR基因与儿童甲亢的相关性。结果在90例甲亢患儿中,检测到3种突变,1种同义突变(c.1842A>G,p.V614V),2个错义突变(c.2119C>T,p.R707W、c.2181G>C,p.D727E)。p.V614V没有改变氨基酸,不影响TSHR的结构和功能,无致病性。p.R707W是与人类癌症发病相关的SNP位点。甲亢组D727E中C等位基因的发生频率为86.7%,正常对照组为55%,两组间D727E等位基因出现的频率有显著差异(P<0.01)。进一步的logistic回归分析发现,D727E与儿童甲亢可能具有一定的相关性(OR=18.86,P<0.01)。结论本研究对中国广州地区90例甲亢患儿TSHR基因的第10外显子分析,发现3个突变位点(c.1842A>G和p.V614V、c.2119C>T和p.R707W、c.2181G>C和p.D727E),p.V614V和p.R707W与甲亢无关,p.D727E与儿童甲亢可能具有一定的相关性。

人促甲状腺激素受体与Graves病

Graves病（GD）是器官特异性自身免疫性甲状腺疾病，其主要发病机制是机体失去了对促甲状腺激素受体（TSHR）的免疫耐受，从而产生TSHR自身抗体。GD的确切发病机制还不完全清楚，但已明确遗传因素在GD发病中起重要作用。由于TSHR是GD发病的主要抗原，因此其基因可能是GD的易感基因，但目前该基因是否与GD的发病相关还存在争议。

102例先天性甲状腺功能减低症甲状腺发育不良相关基因突变检测

目的对102例先天性甲状腺功能减低症患儿进行甲状腺发育不良相关基因促甲状腺激素受体(TSHR)、PAX8、NKX2-1、NKX2-5、FOXE-2基因突变分析。方法对102例先天性甲状腺功能减低症患儿采外周血并提取DNA,用wafergen验证检测患儿促甲状腺激素受体(TSHR)、PAX8、NKX2-1、NKX2-5、FOXE-2基因突变。PCR扩增患儿甲状腺发育不良相关基因突变位点所在的基因序列,以DNA测序技术检测基因突变。结果发现5种TSHR基因突变c.154C>A[p.Pro52Thr]、c.394G>C[p.Gly132Arg]、c.2066T>G[p.Val689Gly]、c.1576G>A[p.Ala526Thr]和c.2272G>A[p.Glu758Lys],2种PAX8基因单核苷酸多态性位点(SNP)rs189229644和rs200138601,未检测到PAX8、NKX2-1、NKX2-5和FOXE-2基因突变。结论中国人群先天性甲状腺功能减低症患儿存在较高频率的促甲状腺激素受体基因突变,值得进一步开展深入研究。