猪带绦虫TSO45W-4BX与猪CD58分子在大肠埃希菌中的联合表达

目的以猪CD58为分子佐剂,将CD58基因与猪带绦虫疫苗候选抗原基因TSO45W-4BX联合表达,寻找新型抗猪囊尾蚴疫苗。方法分别以重组质粒pGEM-4B和pGEM-CD58为模板,PCR扩增猪带绦虫TSO45W-4BX基因和猪CD58基因,将TSO45W-4BX与酶切处理的pGEX-4T-1定向连接,转化大肠埃希菌JM109,重组质粒经鉴定正确后,在其下游酶切插入CD58基因,PCR扩增和测序证明阅读框正确后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE))和蛋白质印迹法(Westernblotting)分析表达产物的免疫活性。结果pGEX-4BX和pGEX-4BX/CD58分别表达Mr41000和Mr69000的融合蛋白,pGEX-4BX表达产物主要以可溶性形式存在,而pGEX-4BX/CD58却以包涵体形式存在,但两者都能被囊尾蚴病患者血清识别。结论TSO45W-4BX与CD58基因联合表达,TSO45W-4BX仍具有免疫活性。

猪带绦虫45W-4BX和TSOL18的高效表达及免疫效果研究

RT-PCR扩增45W-4B和TSOL18基因,PCR截去45W-4B基因的N端信号肽和C端疏水氨基酸序列形成45W-4BX。将45W-4BX和TSOL18 PCR产物分别亚克隆入pGEX-4T-1,用IPTG诱导表达,取产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化表达产物制成油佐剂疫苗分别免疫家猪,用25 000枚猪带绦虫成熟虫卵进行攻击感染,ELISA检测各组的抗体水平,90 d后剖检计算各组的减虫率。结果表明,45W-4BX和TSOL18基因在大肠杆菌中分别以可溶性和包涵体形式获得高效表达,并能被囊虫病人血清所识别。重组蛋白免疫猪15 d血清抗体即为阳性,30 d左右达到峰值。2种重组抗原的减虫率均在88%以上,与囊虫粗抗原免疫效果相当。这为进一步研制基于45W-4BX和TSOL18的猪囊虫重组基因工程疫苗奠定了基础。

猪带绦虫TSO45W-4B基因的克隆、表达和抗体制备

目的克隆、表达猪带绦虫TSO45W-4B基因,以重组蛋白TSO45W-4B免疫兔制备抗体。方法全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B抗原编码基因,定向克隆至pGEX-1λT表达载体,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B。转化至大肠埃希菌ArcticExpress(DE3)后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达情况。表达产物经谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔,制备抗血清。GST亲和层析柱纯化获得血清中抗体后,ELISA测定抗体效价,蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定抗体特异性。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pGEX-TSO45W-4B构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白相对分子质量(M r)约为40 000,经GST亲和层析后可获得纯度为90%以上的重组蛋白。ELISA结果显示,抗体的效价为1∶512 000。Western blotting分析结果显示,该抗体能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,在约M r40 000处出现一条带,与预期大小一致。结论猪带绦虫TSO45W-4B基因能在大肠埃希菌中表达,制备了TSO45W-4B重组蛋白和兔抗血清。

猪带绦虫不同阶段45W-4BX和18kD基因联合表达及保护性分析

【目的】获得不同发育阶段基因联合表达的具有良好免疫保护性的重组抗原,为研制高效的猪囊虫基因工程疫苗奠定基础。【方法】PCR扩增截去45W-4B基因的信号肽和C端17个疏水氨基酸序列,经BamH I和EcoR I酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化BL21感受态细胞,酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆。测序正确的质粒经EcoR I和Not I酶切处理后与截去信号肽的18 kD基因连接,构建双基因融合表达载体pGEX-4BX/18。用IPTG诱导的表达产物,进行SDS-PAGE电泳、Western blot分析活性。分别用300μg重组GST-4BX、GST-4BX/18蛋白免疫猪,间接ELISA测定抗体水平。感染后90 d剖检计算各组的减虫率,比较评价重组抗原的免疫保护性。【结果】4BX/18 kD在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为50 kD的融合蛋白,并能被人囊虫和感染初期的猪囊虫阳性血清所识别。重组抗原免疫猪后45 d抗体达到峰值,联合表达重组抗原的减虫率为97%,GST-4BX免疫组的减虫率为95%。【结论】重组抗原4BX和4BX/18kD均具有较好的免疫保护效果,有望利用它们研制出抗猪囊尾蚴病的高效疫苗。

猪带绦虫六钩蚴45W-4BX的高效表达、纯化及活性分析

截去猪带绦虫六钩蚴45W-4B基因的N端信号肽和C端17个疏水氨基酸序列形成45W-4BX。设计特异性表达引物,PCR扩增目的片段,经BamH和EcoR酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化BL21感受态细胞。用酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆,测序证明阅读框是否正确。用IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳,Western blot分析其活性。包涵体经纯化、透析复性后作为包被抗原检测囊虫猪和囊虫病人血清中的4B抗体。结果表明,截断的4BX(351bp)基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为相对分子质量40000的融合蛋白,并能被囊虫病人血清所识别。ELISA检测表明,囊虫病人血清中含有高滴度的4B抗体,所以45W-4BX的表达产物有可能作为候选抗原用于囊虫病的诊断和免疫预防。

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达

目的在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化入长双歧杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为55kD,与预期结果相一致。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。

猪带绦虫六钩蚴45W-4BX抗原单克隆抗体的制备及鉴定

将纯化的猪带绦虫六钩蚴45W-4BX重组抗原,采用弗氏完全、不完全佐剂乳化和不加佐剂的方式,3次免疫BALB/C小鼠,检测抗体效价呈阳性后,再经尾静脉加强免疫,取其脾细胞和SP2/0细胞融合,经六钩蚴45W-4BX抗原和GST抗原双系统间接ELISA筛选,获得了18株六钩蚴45W-4BX杂交瘤细胞,按有限稀释法对其中的4株进行了5次亚克隆,最终获取了4株分泌稳定的单克隆细胞株,接种小鼠获取相应的腹水,金标试纸条法鉴定其抗体亚类均属于IgG1类,轻链为κ型;对腹水进行了稳定性试验和单抗初步提纯,并对杂交瘤细胞进行了染色体组型的分析,证明所获单抗能满足常规试验的要求.

猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达

目的:在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒p GEX-TSO45W-4B的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法:将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒p GEX-TSO45W-4B电转化入长双歧杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot分析表达情况。结果:酶切、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和测序证实,重组质粒p GEX-TSO45W-4B成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 k D,经谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)亲和层析后可获得纯度为85%以上的重组蛋白。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗TSO45W-4B血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论:猪带绦虫TSO45W-4B基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌诱导家猪免疫应答

目的 观察猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌口服灌胃和肌肉注射家猪后诱导的免疫应答.方法 12头40日龄健康家猪随机均分为3组,每组4头.口服灌胃组每猪灌胃1011 CFU重组双歧杆菌[溶于50 mL双歧杆菌液体培养基（MRS）],肌肉注射组每猪于猪后腿肌肉注射1011CFU重组双歧杆菌（溶于10 mL MRS）,对照组每猪灌胃50 mL MRS.每次间隔2周,共免疫2次.于免疫后0、2、4、6和8周进行前腔静脉采血,采用ELISA法检测猪血清免疫球蛋白G（IgG）水平;制备猪外周血淋巴细胞（PBMC）,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测猪PBMC增殖水平;收集粪便,测定分泌型免疫球蛋白A（sIgA）水平.结果 与免疫前和MRS对照组相比,口服灌胃组和肌肉注射组猪血清IgG水平、PBMC增殖水平均在免疫后2～8周升高,6周达较高水平;粪便sIgA水平在免疫后2～8周升高,4周达较高水平,差异均具有统计学意义（P＜0.05）.口服灌胃组的IgG、sIgA水平和PBMC增殖水平显著高于肌肉注射组（P＜0.05）.结论 猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌可诱导家猪产生有效的免疫应答,其免疫效果口服灌胃优于肌肉注射.

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18重组蛋白疫苗免疫小鼠诱导的免疫应答

目的观察猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18重组蛋白疫苗免疫小鼠诱导产生的体液和细胞免疫应答。方法将SPF级昆明小鼠60只随机分为3组,每组20只,分别为重组蛋白疫苗组和重组蛋白疫苗加弗氏佐剂组和生理盐水对照组。采用多点皮下注射法免疫3次,间隔2周。于免疫后0、2、4、6、8周摘眼球取血,分离血清,采用ELISA法检测小鼠血清IgG与IgG2a水平;无菌取脾,制备脾细胞悬液,采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测脾细胞增殖水平,采用ELISA法检测小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后产生IL-2和IL-4的能力。结果与0周时及生理盐水对照组相比,免疫小鼠血清IgG水平在免疫后2-8周升高,F值分别为20.108、235.886、209.012、49.058,6周时达较高水平,IgG2a水平在免疫后2-8周升高,F值分别为80.214、76.540、152.314、82.561,6周时达较高水平,脾细胞增殖水平在免疫后2-8周升高,F值分别为21.643、56.982、225.880、151.682,6周时达较高水平,小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后产生的IL-2水平在免疫后2-8周升高,F值分别为16.699、25.967、77.133、34.662,6周时达较高水平,IL-4水平在免疫后2-8周升高,F值分别为26.087、147.353、130.654、62.807,6周时达较高水平,与0周时及生理盐水对照组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）;免疫后2-8周重组蛋白疫苗加弗氏佐剂组与重组蛋白疫苗组比较上述指标差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18重组蛋白疫苗免疫可诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,免疫效果以重组蛋白疫苗加弗氏佐剂组较好。