猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因疫苗表达载体的构建及其免疫原性研究

为研制新型猪囊尾蚴疫苗,将猪带绦虫六钩蚴阶段编码TSOL18的基因定向克隆于真核表达质粒pVAX1,经筛选、鉴定及DNA序列分析正确后,将重组质粒pVAX1/TSOL18转染BHK-21细胞,通过SDS-PAGE、Western blotting、免疫荧光试验等方法检测细胞中表达的TSOL18抗原。结果表明,重组真核质粒pVAX1/TSOL18可在BHK-21细胞中表达TSOL18目的蛋白,表达蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。动物免疫试验表明,真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,这为猪囊尾蚴病基因疫苗的研究奠定了良好基础。

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达

目的在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化入长双歧杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为55kD,与预期结果相一致。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。

猪带绦虫六钩蚴TSOL18真核表达载体pVTSOL18m的构建

根据Kozak原理设计引物,以重组原核表达载体pGEX-TSOL18为模板扩增TSOL18基因,用EcoRI、XhoI酶切后与经相同处理的pVAX1载体连接并转化JM109感受态细胞,经测序证明读码框正确后,再根据PCR点突变的方法设计引物,将目的基因NruⅠ位点中的碱基(第347位)经三次PCR反应突变,最终获得含突变位点的TSOL18m基因,EcoRⅠ、XhoⅠ再次酶切后与pVAX1载体连接,成功构建了含点突变的重组pVAX1表达载体,为TSOL18基因重组犬2型腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。

猪带绦虫TSOL18-SP蛋白的原核表达及其多抗的制备

对TSOL18基因中4个碱基进行定点突变，并截去N端16个氨基酸的信号肽，构建pGEX—TSOL18-SP原核表达载体，IPTG诱导表达后进行产物的SDS-PAGE及Western blot分析；用改造的纯化蛋白免疫家兔后采集血清，经琼脂双扩散试验检测血清抗体效价．结果表明：TSOL18基因改造后长度为345 bp，共有7个碱基发生突变，但氨基酸序列没有改变，与GenBank收录的TSOL18基因核苷酸序列相似性为97％，氨基酸序列相似性为100％．SDS-PAGE及Western blot分析表明：改造的重组菌诱导后可高效表达可溶性目的蛋白，且TSOL18-SP分子量约为38．7kD，与猪带绦虫六钩蚴阳性血清反应性强；琼脂双扩散法测定免疫兔血清抗体效价为1：32～64，说明表达的TSOL18-SP蛋白具有较好的免疫原性．

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌诱导家猪免疫应答

目的 观察猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌口服灌胃和肌肉注射家猪后诱导的免疫应答.方法 12头40日龄健康家猪随机均分为3组,每组4头.口服灌胃组每猪灌胃1011 CFU重组双歧杆菌[溶于50 mL双歧杆菌液体培养基（MRS）],肌肉注射组每猪于猪后腿肌肉注射1011CFU重组双歧杆菌（溶于10 mL MRS）,对照组每猪灌胃50 mL MRS.每次间隔2周,共免疫2次.于免疫后0、2、4、6和8周进行前腔静脉采血,采用ELISA法检测猪血清免疫球蛋白G（IgG）水平;制备猪外周血淋巴细胞（PBMC）,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测猪PBMC增殖水平;收集粪便,测定分泌型免疫球蛋白A（sIgA）水平.结果 与免疫前和MRS对照组相比,口服灌胃组和肌肉注射组猪血清IgG水平、PBMC增殖水平均在免疫后2～8周升高,6周达较高水平;粪便sIgA水平在免疫后2～8周升高,4周达较高水平,差异均具有统计学意义（P＜0.05）.口服灌胃组的IgG、sIgA水平和PBMC增殖水平显著高于肌肉注射组（P＜0.05）.结论 猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌可诱导家猪产生有效的免疫应答,其免疫效果口服灌胃优于肌肉注射.

猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因在大肠埃希菌ArcticExpress（DE3）中的表达、纯化和兔抗血清的制备

目的构建猪带绦虫pGEX—TS045W-4B-TSOL18重组质粒，纯化重组融合蛋白及制备兔抗重组蛋白血清。方法用疏水甘氨酸接头（Gly,Ser），连接TS045W-4B和TSOL18编码基因，通过全基因合成猪带绦虫TS045W-4B—TSOL18融合基因。将融合基因定向克隆到pGEX—1λT表达载体上，构建重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18，再用重组质粒转化大肠埃希菌（E．col）ArcticExpress（DE3）。用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导其表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达情况，亲和层析纯化获得重组融合蛋白。用纯化的重组蛋白按0．5mg／只与弗氏完全佐剂（CFA）混合，于兔后腿肌肉及背部皮下多点免疫注射；2周后再用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂（IFA）混合加强免疫，此后每隔10d按第2次免疫法重复加强免疫，第4次免疫后6d，采集兔心脏血并分离血清，立即纯化及制备抗血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗血清的效价，采用蛋白印迹（Western blot）法鉴定抗血清的特异性。结果全基因合成的TS045W-4B—TSOL18融合基因片段长度为789bp。酶切证实pGEX—TS045W-4B—TSOL18重组质粒成功构建，测序结果获得的基因片段大小为789bp，与预期大小相符。SDS—PAGE分析和亲和层析后显示，重组质粒在转化E．col ArcticExpress（DE3）后，获得了相对分子质量约为55×10。的重组融合蛋白，纯度为85％。EUSA测定兔抗血清的效价为1：512000，Westernblot证实抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应，在相对分子质量约为55×10^3处出现1条与预期大小-致的特异性条带。结论成功地构建猪带绦虫重组质粒pGEX—TS045W-4B—TSOL18及制备了高纯度的TS045W-4B—TSOL18重组融合蛋白和高滴度的兔抗重组蛋白血清。