TUNEL技术方法的探讨

探讨末端脱氧核苷酸转移酶介导的 d UTP缺口标记技术 (TUNEL)的染色方法 ,以期提高特异性与敏感性。采用以去势 (经手术切除睾丸 )后天数不同的大白鼠前列腺 ,用 TUNEL 法染色 ,观察不同时期的细胞凋亡水平 ,对经典的 TUNEL 法进行改良 ,将染色结果与 TU NEL 经典法和 HE染色法进行对比。结果表明 :采用改良法后 ,阳性细胞明显增加 ,而且着色深 ,凋亡指数明显增高 (P<0 .0 1)。

TUNEL法检测类猪圆环病毒2型因子P1诱导猪免疫器官细胞凋亡的研究

研究类猪圆环病毒2型因子P1体内诱导的细胞凋亡作用。将P1分子克隆接种普通仔猪,用原位末端标记技术(TUNEL)检测猪的扁桃体、脾脏、腹股沟淋巴结等免疫器官细胞的凋亡情况。猪感染P1后21和35 d的扁桃体、脾脏和腹股沟淋巴结等免疫器官细胞出现了凋亡。P1可能引起猪的免疫抑制。

Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色技术检测神经细胞凋亡的对比研究

目的：利用Hoechst33342/PI双染法和原位末端标记法（TUNEL染色检测纳米二氧化硅（nm-SiO2）对神经细胞凋亡的影响，比较两种检测方法的优缺点。方法：以体外培养的人神经母细胞瘤SK-N-SH为研究对象，15和30 nm粒径的nm-SiO2（剂量为2.5、5、10μg/mL）分别处理细胞24 h，另设1-5 m SiO2组和溶剂对照组，采用Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色检测各处理组对SK-N-SH细胞凋亡的影响。结果：与对照组相比，两种检测方法分析均显示了nm-SiO2处理组SK-N-SH细胞凋亡率显著增加（P〈0.05），且具有尺寸、剂量依赖性，而微米级SiO2对凋亡的影响不显著（P〉0.05）。结论：nm-SiO2能诱导SK-N-SH细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染法特异性高，简单易行；TUNEL法灵敏度高，能检测少量的细胞凋亡，但成本较高，两种方法可结合使用以便更加准确的检测神经细胞的凋亡。

TUNEL法和Annexin V-FITC流式细胞分析法检测成纤维细胞凋亡的对比研究

目的通过Annexin V-Fitc流式细胞分析法和TUNEL法检测凋亡,比较两种方法的优缺点。方法以成纤维细胞为对象构建细胞体外培养-力学刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统,分别给予周期性张应力(频率为10个循环/min,每一循环包括3 s收缩/3 s舒张,力值定为12%)刺激6、12、24 h,并设立正常对照组。采用TUNEL染色法和Annexin VFitc流式细胞法检测成纤维细胞凋亡。结果 TUNEL染色结果显示,实验组较对照组的细胞核固缩,边界清楚,胞质淡染,染色质呈特异的棕黄色着染,而正常细胞的胞核不着染。流式细胞仪实验结果显示,实验组的G0/G1期的细胞比例明显增多,相对应的S期细胞比例明显减少,而在G2/M期较对照组却出现了明显的变化,6、12h组DNA含量分别为352.0±1.0、301.1±1.1,较未加力组255.2±1.7有显著延长,而24 h加力组DNA含量303.4±10.6与6 h组比较细胞周期却出现了缩短。结论Annexin V-Fitc流式细胞分析法特异性高,TUNEL法灵敏度高,两种方法相结合检测细胞凋亡更准确。

TUNEL法检测乳酸杆菌对小鼠宫颈鳞癌的凋亡诱导作用

目的应用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法———TUNEL法,检测乳酸杆菌(Lactoba-cillus,LB)对小鼠宫颈鳞癌的凋亡诱导作用。方法建立615近交系小鼠U14移植瘤动物模型,并随机分组,TUNEL法检测各组细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)。结果乳酸杆菌实验组的AI为(11.25±4.06)%,与对照组的差异有非常显著性(P<0.01),与抗癌药顺铂组的差异有显著性(P<0.05)。结论乳酸杆菌可诱导U14移植瘤细胞凋亡,这可能是其抑癌机制之一。

对凋亡细胞TUNEL染色操作中的体会

凋亡细胞的TUNEL染色已在科学研究中广泛应用。由于TUNEL染色的步骤多,操作精细,影响DNA断裂的因素多,实验结果往往不够准确致使实验失败。总结多年实践经验,拟从组织的取材方式、取材大小、固定剂选择、组织离体后缺血时间、组织在固定剂内的固定时间以及实验操作中的诸多细节等方面进行介绍。

TUNEL法检测PRRSV感染Marc-145细胞凋亡的研究

为了研究PRRSV诱导Marc-145细胞凋亡的动态变化规律,收集PRRSV-SC1株感染Marc-145细胞后0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和相同时间点未接种病毒的细胞样品,采用TUNEL法进行细胞凋亡的检测。结果表明,PRRSV能诱导Marc-145细胞发生凋亡;在PRRSV感染后24h开始出现凋亡,48h凋亡更加明显,72h达到高峰,随后细胞凋亡水平又有所下降,在感染后144h,细胞的凋亡水平低于正常组。

电镜与TUNEL技术检测银屑病皮肤细胞凋亡的比较研究

目的 评价银屑病皮肤中细胞凋亡的情况。方法 采用电镜与TUNEL法对银屑病表皮及真皮的细胞凋亡情况进行了观察并比较其结果。结果 电镜下银屑病表皮颗粒层中细胞凋亡并不常见 ,在棘细胞层与基底层则更少 ,但TUNEL染色见阳性细胞广泛分布于表皮各层。结论 认为电镜与TUNEL所见不同的原因除了TUNEL法评价细胞凋亡的局限性以外 ,还有两种可能的解释 :①银屑病中角质形成细胞凋亡在早期 (可被TUNEL染色 )即受到抑制而不能继续发展到具有典型形态学改变的中晚期被电镜识别 ;②TUNEL阳性的角质形成细胞 (含凋亡早期的DNA断链 )在发展到具有典型形态学改变之前就已从皮表脱落。

TUNEL技术原位检测肝癌细胞凋亡──激光共聚焦显微镜观察

目的：用缺口末端标记技术（TUNEL）对肝硬变、肝细胞肝癌及培养肝癌细胞系的细胞调亡进行形态学观察．方法：采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒对福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织和培养肝癌细胞进行TUNEL染色，激光共聚焦显微镜观察肝细胞凋亡的形态特征．结果：TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色强荧光，位于胞核，呈环行、小圆形或颗粒状，提示凋亡细胞有典型的新月体状染色质边集、核浓缩以及有大量微核体的形成．在阿霉素诱导的HCC-9204细胞系还可见调亡细胞的出泡现象．TUNEL阳性细胞大多HE染色表现为调亡的细胞．结论：TUNEL技术加激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞是目前原位观察调亡的理想方法，特别适用于调亡细胞的早期检测．

用TUNEL法检测植物原生质体的凋亡

TUNEL是近年来发展的一种对凋亡细胞进行原位检测的方法 ,可以特异性地标记完整的凋亡细胞核或凋亡小体的染色体 3’_OH断裂末端 ,但在植物细胞中的应用还不多。本文报道应用TUNEL法检测胡萝卜原生质体的凋亡 ,并与DNA电泳、彗星电泳等方法进行了比较 ,结果表明它是一种适用于植物原生质体凋亡检测的灵敏度较高的方法。

AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡的对比研究

目的通过AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡,比较两种方法的优缺点。方法以体外培养人肝细胞株HL-7702为研究对象,分别设立TGF-β1组(加入TGFβ-1至终浓度为20 ng/ml,作用72 h后收集细胞进行检测)和正常对照组(加入等量PBS),采用AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测肝细胞凋亡。结果AnnexinⅤ/PI流式细胞分析显示,TGFβ-1组与正常对照组相比肝细胞的早期凋亡率和总凋亡率均显著增加[(10.55±4.71)%vs(5.98±2.97)%,P<0.01;(19.94±3.68)%vs(13.27±4.62)%,P<0.05]。TUNEL法检测显示,细胞核中有棕黄色着染者为阳性细胞,细胞呈典型的凋亡形态学改变,即表现为变小、变圆、核固缩;而正常细胞的胞核不着染。经Iimage-Pro Plus图像分析软件处理,显示TGF-β1组与正常对照组相比肝细胞凋亡率显著增加[(30.25±6.43)%vs(4.75±0.96)%,P<0.01]。结论AnnexinⅤ/PI流式细胞分析法特异性高,TUNEL法灵敏度高,两种方法相结合检测细胞凋亡更准确。

TUNEL法检测复方葛根片对衰老模型大鼠肝脏细胞的保护作用

目的研究复方葛根片对衰老模型大鼠肝脏细胞的保护作用。方法 40只大鼠随机分为正常组、模型组(生理氯化钠10ml·kg-1)和复方葛根片低、中、高剂量组[200、400、800mg(生药)·kg-1],每组8只。除正常组外,其他各组大鼠每天9∶00腹腔注射D-半乳糖溶液250mg·(kg·d)-1复制衰老模型,每天15∶00灌胃注射相应药物,连续给药8周。计算肝脏指数,采用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测衰老大鼠肝脏组织的细胞凋亡情况。结果与正常组比较,模型组大鼠肝脏指数显著增加(P<0.01);肝脏组织中红色荧光明显增多,凋亡指数显著增加(P<0.01);与模型组比较,复方葛根片高、中、低剂量组中大鼠肝脏指数显著减小(P<0.05或P<0.01);肝脏组织中红色荧光明显减少,亮度降低,凋亡指数显著减小(P<0.05或P<0.01)。结论复方葛根片能抑制衰老模型大鼠肝细胞凋亡,减少凋亡细胞的产生,起到保护肝脏细胞的作用。

固定对用TUNEL技术原位检测细胞凋亡的影响

用TUNEL技术原位检测凋亡细胞对组织的处理方法较为敏感。本研究采用灌注固定及浸润固定处理的石蜡切片来比较固定处理对细胞凋亡检测的影响。结果显示成年大白兔睾丸 (正常及输精管结扎术后的 )内凋亡的生精细胞 ,在用 4%的多聚甲醛先灌注固定然后浸润固定处理后可以检测到 ,仅用Bouin液浸润固定整个器官 2 4小时的方法检测不到凋亡细胞。尽管其原因不清楚 ,但该结果可能提示TUNEL法对凋亡细胞检测的敏感度高度依赖于固定处理情况 ,故对凋亡细胞的阴性检测结果的解释应慎重。

实验性衰老大鼠下颌下腺β-半乳糖苷酶、TUNEL的改变

目的探讨D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺β-半乳糖苷酶(β-gal)表达及凋亡细胞的改变。方法通过β-gal活性的检测,观察下颌下腺衰老细胞数目的改变;应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞,观察下颌下腺凋亡细胞数目改变。结果β-gal阳性表达以模型组最高,正常组最低;TUNEL阳性表达以模型组最高,正常组最低。结论D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺β-gal表达增加,凋亡细胞数较正常组明显增多。

改进的TUNEL技术在检测急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡中的应用

目的:探讨并总结末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)在急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌细胞凋亡检测中的方法学。方法:运用改进的TUNEL法检测大鼠AMI心肌组织中的细胞凋亡。结果:改进TUNEL法能特异地显示AMI大鼠心肌组织凋亡细胞核,对比明显,背景清晰,组织结构与细胞轮廓完整,染色结果稳定可靠,敏感性高,特异性强。结论:改进后的TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡效果理想,值得推广。

糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡——TUNEL法研究

目的： 确定早期糖尿病视网膜病变 （糖网病） 大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡并观察凋亡特征。方法： 选成年ｗ ｉｓｔａｒ大鼠４０ 只， 随机分成正常对照（ Ｃ Ｏ Ｎ）、糖尿病１ 月 （ Ｄ Ｍ１）、３ 月 （ Ｄ Ｍ３） 及６ 月 （ Ｄ Ｍ ６） 组。采用链脲佐菌素腹腔内注射诱发大鼠糖尿病。取各组大鼠视网膜制备血管铺片， Ｔ Ｕ Ｎ Ｅ Ｌ法标记， 光镜观察。结果： Ｔ Ｕ Ｎ Ｅ Ｌ法标记的阳性周细胞核出现于 Ｄ Ｍ３ 和 Ｄ Ｍ６ 组，而内皮细胞见于 Ｄ Ｍ ６ 组。 Ｃ Ｏ Ｎ 和 Ｄ Ｍ１ 组未见阳性反应细胞。被标记的周细胞核小而圆， 位于毛细血管侧面， 稍突出于血管壁。而内皮细胞核大而呈现椭圆形， 位于毛细血管中央， 与血管平行， 阳性反应细胞染色质分布不均， 表现为环形核、新月形核等典型的凋亡细胞特征。结论： 早期糖网病大鼠视网膜毛细血管周细胞丧失的性质为细胞凋亡， 内皮细胞亦存在凋亡。

TUNEL法检测白藜芦醇对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的影响

目的通过TUNEL法检测白藜芦醇(RES)对佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜细胞的凋亡影响,探讨RES对AA大鼠应用效果。方法0.1mL弗氏完全佐剂注射SD大鼠左足趾皮下诱导关节炎复制AA模型,24d后,取非致炎侧踝关节小块滑膜组织分离、培养滑膜细胞,将传代后的滑膜细胞加入不同浓度的RES溶液,利用TUNEL法观察滑膜细胞凋亡情况。结果TUNEL法观察到加入高浓度(20、50μmol/L)RES后TUNEL阳性细胞数明显增多。结论RES能促进AA大鼠滑膜细胞的凋亡。

TUNEL法检测自拟复方葛根片对老龄大鼠子宫的保护作用

目的研究自拟复方葛根片对老龄大鼠子宫的保护作用。方法 40只Wistar大鼠随机分成5组(正常组、模型组、复方葛根片低、中、高剂量组),每组8只。按相关试剂盒操作分别测定血清中雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、泌乳素(PRL)浓度;采用TUNEL法检测衰老大鼠子宫的细胞凋亡情况。结果与正常组比较,模型组大鼠E2浓度降低,FSH、LH、PRL浓度升高(P<0.01),造模成功;与模型组比较,复方葛根片各用药组中E2浓度升高,FSH、LH、PRL浓度降低(P<0.05或P<0.01)。与正常组比较,模型组大鼠子宫切片中红色荧光明显增多,凋亡指数显著增加(P<0.01);与模型组比较,复方葛根片各用药组中红色荧光明显减少,凋亡指数显著减小(P<0.05或P<0.01)。结论复方葛根片能调节雌激素水平,同时抑制老龄大鼠子宫细胞凋亡,减少凋亡细胞的产生,起到保护子宫,延缓衰老作用。

石蜡切片TUNEL法检测肉仔鸡法氏囊细胞凋亡的条件优化

从蛋白酶K的浓度、DAB显色时间、苏木素复染时间等对采用石蜡切片TUNEL法检测10日龄健康ROSS308肉仔鸡法氏囊组织内细胞凋亡的条件进行了优化。结果表明,TUNEL法最佳条件蛋白酶K浓度为20μg/mL,DAB显色时间为8 min,苏木素复染时间为10 s。优化后的石蜡切片TUNEL法,即60℃烤片5 h,20μg/mL蛋白酶K 37℃消化30 min,DAB显色8 min,苏木素复染10 s时,能特异地显示凋亡细胞为棕黄色,其他细胞核为蓝色,且对比明显,背景浅,组织结构完整清晰。

TUNEL方法对基底细胞癌细胞凋亡的观察

采用原位特异性DNA片断标记法（TUN）对12例基底细胞癌进行了研究，结果发现肿瘤细胞团块中心部位有许多不同大小的圆形式印圆形凋亡细胞。提示细胞调亡与BCC的生长缓慢及极少转移的临床特点有关，并且可能在BCC的自然消退中发挥重要的作用。