LncRNA TUSC7通过调控miR-182/TBX5轴抑制 结直肠癌的增殖迁移和侵袭

目的:探讨长链非编码RNA抑癌候选基因7(long non-coding RNA tumor suppressor candidate 7,LncRNA TUSC7)通过调控微小RNA-182(microRNA-182,miR-182)/T-框蛋白5(T-box5,TBX5)轴对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)增殖、迁移和侵袭的影响。方法:实时荧光定量PCR检测LncRNA TUSC7、miR-182和TBX5在90对CRC腺癌组织及远端正常组织中的表达水平,通过临床样本数据分析三者的相关性,并检测LncRNA TUSC7在人CRC细胞系LoVo、SW1116、CaCO 2、HCT116和SW480以及正常人结肠粘膜细胞系NCM460中的表达。RNA荧光原位杂交实验检测LncRNA TUSC7的亚细胞定位。SW480细胞分10组,敲减TUSC7(shTUSC7)组和敲减对照(shNC)组、过表达TUSC7(oeTUSC7)组和过表达对照(oeNC)组、miR-182过表达(miR-182 mimic)组和过表达对照(NC mimic)组、干涉miR-182(miR-182 inhibitor)组和干涉对照(NC inhibitor)组、同时过表达TUSC7和miR-182(oeTUSC7+miR-182 mimic)组及同时过表达TUSC7、miR-182和TBX5(oeTUSC7+miR-182 mimic+oeTBX5)组,分别进行shTUSC7、shNC、oeTUSC7、oeNC、miR-182 mimic、NC mimic、miR-182 inhibitor、NC inhibitor转染及oeTUSC7+miR-182 mimic共转染和oeTUSC7+miR-182 mimic+oeTBX5共转染。CCK8、克隆形成、流式细胞术和Transwell实验测定LncRNA TUSC7、miR-182和TBX5对SW480细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。双荧光素酶报告基因系统实验、RNA免疫沉淀实验、RNA pull-down实验和Western blot验证LncRNA TUSC7、miR-182和TBX5的相互关系。Kaplan-Meier法进行生存分析。将裸鼠随机分为4组(n=12):shTUSC7组、shNC组、oeTUSC7组和oeNC组。分别于右侧腋窝内皮下接种shTUSC7、shNC、oeTUSC7、oeNC转染的SW480细胞。用于在体评价LncRNA TUSC7对CRC肿瘤生长的影响及生存分析。结果:与癌旁正常组织相比,在CRC组织中,LncRNA TUSC7(1.53±0.84 vs 6.97±3.97)和TBX5(0.58±0.29 vs 3.25±1.51)低表达而miR-182(0.54±0.33 vs 0.09±0.06)高表达(P<0.05),且LncRNA TUSC7与miR-182表达负相关(R2=0.09077)而与TBX5的表达正相关(R2=0.08371),miR-182与TBX5的表达负相关(R2=0.06914;P<0.05)。与NCM460(1.00±0.05)细胞相比,LncRNA TUSC7在LoVo(0.51±0.08)、SW1116(0.41±0.10)、CaCO 2(0.42±0.11)、HCT-116(0.53±0.10)和SW480(0.35±0.07)细胞中均显著低表达(P<0.05),且在SW480细胞中表达最低。LncRNA TUSC7定位在在CRC细胞质中表达。与shNC/oeNC组相比,沉默/过表达LncRNA TUSC7促进/抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭,而减少/增加细胞凋亡(P<0.05)。LncRNA TUSC7可直接靶向miR-182,此外,TBX5是miR-182的一个直接的靶点。从机制上讲,LncRNA TUSC7通过靶向miR-182促进TBX5的表达进而抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭并促进凋亡。与体外实验结果相一致,LncRNA TUSC7可在体抑制CRC肿瘤的生长。结论:LncRNA TUSC7在CRC组织和细胞中低表达,且LncRNA TUSC7通过调控miR-182/TBX5轴抑制CRC的增殖、迁移和侵袭。

葛根芩连汤调节lncRNA-TUSC7/miR-182/TBX5信号轴对结直肠癌发生发展的作用机制研究

目的探究葛根芩连汤调节lncRNA-TUSC7/miR-182/TBX5信号轴对结直肠癌(CRC)发生发展的作用机制。方法1)体外实验:将培养好的HCT-116细胞分为对照组、oe-NC组、oe-TUSC7组、inhibitor-NC组、miR-182 inhibitor组、oe-TUSC7+miR-NC组、oe-TUSC7+miR-182 mimic组。RTqPCR检测lncRNA-TUSC7、miR-182、TBX5 mRNA的表达;CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blotting检测细胞TBX5、Ki67、Caspase-9蛋白表达水平;双萤光素酶报告基因实验检测miR-182与lncRNA-TUSC7和TBX5的靶向关系。2)体内实验:皮下注射DMH建立大鼠CRC模型,将大鼠分为模型组、葛根芩连汤组、葛根芩连汤+LV-NC组、葛根芩连汤+LV-shTUSC7组,另设对照组(无处理)。测量肿瘤数量、质量和体积;RT-PCR检测肿瘤组织TUSC7、miR-182、TBX5 mRNA的表达;Western blotting检测TBX5、Ki67、Caspase-9蛋白表达。结果1)体外实验:与对照组和oe-NC组相比,oe-TUSC7组细胞中TUSC7、TBX5 m RNA表达、凋亡率、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著升高,miR-182表达、OD450值(24、48 h)、Ki67表达显著降低(P<0.05);与inhibitor-NC组相比,miR-182 inhibitor组细胞中TBX5 mRNA表达、凋亡率、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著升高,miR-182表达、OD450值(24、48 h)、Ki67表达显著降低(P<0.05);与oe-TUSC7+miR-NC组相比,oe-TUSC7+miR-182 mimic组细胞中TBX5 m RNA表达、凋亡率、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著降低,miR-182表达、OD450值(24、48h)、Ki67表达显著升高(P<0.05);双萤光素酶报告基因实验验证miR-182与TUSC7和TBX5存在靶向调控关系。2)体内实验:与对照组相比,模型组大鼠肿瘤数量、肿瘤质量和肿瘤体积、miR-182表达、Ki67蛋白表达显著升高,肿瘤组织中TUSC7和TBX5 m RNA表达、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,葛根芩连汤组大鼠肿瘤数量、肿瘤质量和肿瘤体积、肿瘤组织miR-182表达、Ki67表达显著降低,肿瘤组织TUSC7和TBX5 mRNA表达、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著升高(P<0.05);与葛根芩连汤组和葛根芩连汤+LV-NC组相比,葛根芩连汤+LV-shTUSC7组大鼠肿瘤数量、肿瘤质量和肿瘤体积、miR-182表达、Ki67表达显著升高,肿瘤组织中TUSC7和TBX5 m RNA表达、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论葛根芩连汤可能通过上调TUSC7,海绵化miR-182,从而促进TBX5表达,进而抑制CRC细胞的生长。

长链非编码RNA TUSC7对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖的影响

目的探讨长链非编码RNA TUSC7在人皮肤恶性黑色素瘤(malignant melanoma,CMM)细胞株中的表达及其对人黑色素瘤细胞增殖的影响。方法采用qRT-PCR技术检测人皮肤CMM组织和良性痣组织,CMM细胞株G-361、SK-MEL-1、A375、A875和正常人表皮黑色素细胞系HEMn-LP中TUSC7的表达。将CMM A375细胞分别转染TUSC7过表达质粒(pcDNATUSC7组)和阴性对照序列(pcDNA3.1组),分别采用CCK-8法和克隆形成实验检测两组细胞的增殖情况,采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果 60例CMM组织和CMM细胞株中TUSC7的表达水平显著低于20例良性痣组织和正常人表皮黑色素细胞(P<0.05)。A375细胞过表达质粒pcDNA-TUSC7转染组中TUSC7表达水平显著高于pcDNA3.1组,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8和克隆集落形成实验结果表明pcDNA-TUSC7组A375细胞增殖指数和细胞克隆数均显著低于pcDNA3.1组,流式细胞术检测凋亡率结果表明pcDNA-TUSC7组A375细胞凋亡率均显著高于pcDNA3.1组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CMM细胞株中TUSC7呈低表达,上调TUSC7表达能显著抑制CMM细胞的增殖和克隆形成能力,促进细胞凋亡,TUSC7可能参与CMM的恶性进展。

LncRNA TUSC7对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

目的探讨LncRNA TUSC7对人骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响。方法构建LncRNA TUSC7过表达质粒,选择正常成骨细胞hFOB 1.19和MG-63、U-2OS骨肉瘤3种细胞株为素材,将重组质粒TUSC7和空质粒pcDNA 3.1分别对MG-63和U-2OS细胞进行转染,正常成骨细胞hFOB 1.19不转染,并采用CCK-8实验、Transwell迁移实验观察TUSC7对细胞增殖和迁移能力的影响。结果成功构建LncRNA TUSC7过表达质粒,MG-63、U-2OS骨肉瘤未转染组、空质粒组的细胞增殖能力和迁移能力均大于正常细胞组,差异有统计学意义(P<0.05),U-2OS转染组、MG-63转染组的增殖能力与正常细胞组相比,差异无统计学意义(P>0.05);MG-63转染组与正常细胞组相比,差异有统计学意义(P<0.05);MG-63与U-2OS骨肉瘤空质粒组与未转染组比较,差异无统计学意义(P>0.05),MG-63与U-2OS骨肉瘤转染组的细胞增殖能力和迁移能力均大于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);MG-63与U-2OS骨肉瘤转染组与空质粒组相比,差异无统计学意义(P>0.05);U-2OS转染组与MG-63转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LncRNA TUSC7具有抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭的能力,对U-2OS骨肉瘤的穿膜的抑制效果更好。

食管鳞癌患者血清中lncRNA-TUSC7的表达及与细胞侵袭转移的关系

目的探究长链非编码lncRNA-TUSC7在食管鳞癌患者血清中表达的临床意义并进一步评估其对食管癌细胞侵袭和转移能力的影响。方法选取2017年1月~2019年5月南阳市第二人民医院和南阳市中心医院收治的60例食管鳞癌患者的血清,同时选取60例年龄、性别匹配的健康体检者血清作为对照组。采用RT-qPCR方法检测血清中TUSC7的表达,分析其与临床病理特征的关系。同时以正常食管上皮细胞为对照,检测4种食管鳞癌细胞系中TUSC7的表达,进一步通过体外过表达或抑制TUSC7,进行MTT,划痕实验和细胞侵袭实验分析TUSC7对细胞迁移及侵袭的影响。Western blot检测过表达或抑制TUSC7对食管鳞癌细胞上皮间质转化(EMT)的标志物(MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)蛋白表达的影响。结果食管鳞癌患者血清中LncRNATUSC7的表达低于正常健康对照组(P<0.05);TUSC低表达与肿瘤分期、淋巴结转移及组织浸润程度相关(P<0.05)。细胞水平上实验组TUSC7表达水平低于对照组(P<0.05);过表达TUSC7可显著抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);并提高KYSE-30细胞EMT相关蛋白E-cadherin,而降低MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量(P<0.05);而抑制TUSC7后结果相反。结论TUSC7在ESCC血清和细胞系中表达下调,与食管鳞癌淋巴结转移相关,且具有通过EMT促进肿瘤细胞迁移和侵袭的功能。因此血清中TUSC7具有成为食管鳞癌诊疗和转移监测的分子标记物的可能。