实时荧光定量PCR检测膀胱癌TWIST1基因启动子的甲基化状态

目的建立针对TWIST1基因启动子甲基化状态的荧光定量检测方法,进而评估其在膀胱癌临床研究的应用前景。方法应用实时荧光定量PCR方法检测南通地区50例确诊膀胱癌患者和25例非膀胱癌的健康对照者的尿液标本中TWIST1基因启动子的甲基化和非甲基化含量,对其甲基化率进行对比。结果正常人的TWIST1启动子的甲基化率为8.1%～17.3%,平均值为12.3%,膀胱癌患者的甲基化率为25.2%～48.3%,平均值为38.2%,膀胱癌患者的TWIST1基因启动子甲基化率有明显的增高(P<0.05)。结论 TWIST1基因启动子区在膀胱癌中异常甲基化,能够作为有效检测膀胱癌的基因。

TWIST1在人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及血管形成中的作用

探讨TWIST1在原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移及体外血管生成中的作用。用有靶向人TWIST1基因shRNA(pLL3.7-shTwist1-GFP)的慢病毒液感染试验组细胞,同时以携带Scramble shRNA的慢病毒液(pLL3.7-shCtrl-GFP)感染对照组细胞,用流式细胞术测定细胞感染效率,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测shRNA的基因沉默效率。通过制作细胞生长曲线、Annexin V/7AAD染色流式细胞术、细胞划痕实验、小管形成实验、qRT-PCR检测TWIST1表达降低对HUVECs的增殖、凋亡、迁移、血管形成能力以及血管生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)基因表达的影响。试验组TWIST1基因表达下降为对照组的30%,表明shTWIST1能有效降低TWIST1基因的表达。与对照组相比,敲降TWIST1能明显抑制HUVECs的增殖(P<0.01),诱导细胞凋亡(P<0.05)。试验组HUVECs划痕愈合率、体外生成的血管样结构数目和总小管分支长度均显著低于对照组(P<0.01);与对照组相比,试验组HUVECs中VEGFR2的表达显著降低(P<0.01)。通过探究HUVECs表达的TWIST1在内皮细胞增殖、存活、迁移和毛细血管样结构的形成中的作用,为TWIST1作为抑制肿瘤血管新生治疗的新靶点提供一定的理论依据。

siRNA沉默Twist1增强吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡的研究

目的通过抑制Twist1来观察胰腺癌细胞对吉西他滨化疗敏感性的变化。方法通过靶向人Twist1基因小干扰RNA(siRNA)抑制Twist1的表达;用Western法检测Twist1的表达、Annexin V/PI染色和流式细胞术检测吉西他滨诱导的细胞凋亡;通过Western blot检测caspase及可能的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和线粒体途径;用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内活性氧和线粒体膜的电位。结果 Twist1沉默显著增加了Panc-1细胞对吉西他滨的敏感性,JNK/线粒体的途径被激活,Twist1 siRNA诱导线粒体膜去极化同时显著上调线粒体分裂相关蛋白Fis1并降低融合相关蛋白Mfn1的表达。Twist1 siRNA提高了细胞内活性氧(ROS)的水平,与吉西他滨联合治疗进一步增加ROS。结论 siRNA介导的Twist1沉默在PANC-1细胞对吉西他滨化疗耐受中扮演了关键角色,Twist1沉默可能作为胰腺癌治疗的一种有效方法。

Twist1基因对食管鳞癌迁移和侵袭的影响

目的 研究Twist1基因在食管鳞癌中的表达、临床病理意义及对食管鳞癌迁移和侵袭的影响.方法 选取30例行手术切除的食管鳞癌患者的食管鳞癌组织和癌旁正常组织标本,实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot方法检测Twist1 mRNA和蛋白表达水平.以癌旁正常组织Twist1 mRNA表达水平为对照,检测三株食管鳞癌细胞株K70、K140、EC109的Twist1 mRNA相对表达水平,分析其与患者临床病理特征间的关系.选取食管鳞癌细胞株EC109分别采用细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验,分别转染Twist1小干扰RNA及对照双链无义RNA,比较两者之间的变化情况.结果 食管鳞癌组织中Twist1 mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织（1.91 ± 0.93比0.54 ± 0.26）,差异有统计学意义（P〈0.01）;三种食管鳞癌细胞株K70、K140、EC109中Twist1 mRNA相对表达水平明显高于癌旁正常组织（2.30 ± 0.34、1.78 ± 0.28和4.37 ± 0.25比1.00 ± 0.48）,差异有统计学意义（P〈0.05）.食管鳞癌组织中Twist1蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织（1.35 ± 0.66比0.25 ± 0.05）,差异有统计学意义（P〈0.05）.食管鳞癌组织Twist1 mRNA相对表达水平与淋巴结转移、浸润程度有相关性（P〈0.05）.分别转染Twist1小干扰RNA及对照双链无义RNA后食管鳞癌细胞株EC109中Twist1 mRNA表达水平分别为0.45 ± 0.16和1.00 ± 0.20,Twist1蛋白表达水平分别为0.24 ± 0.09和0.58 ± 0.10,两者比较差异均有统计学意义（P〈0.05）.细胞划痕实验结果表明,运用RAN干扰技术下调Twist1表达后,食管鳞癌细胞株EC109的36和72 h 迁移率明显低于对照双链无义 RNA[（32.6 ± 4.7）%比（16.2 ± 6.0）%和（71.9 ± 4.7）%比（53.2 ± 6.6）%],差异有统计学意义（P〈0.05）;Transwell细胞侵袭实验结果显示,转染Twist1小干扰RNA的EC109穿入小室膜底部的细胞总数较转染对照双链无义RNA明显减少（92.5 ± 8.1比32.7 ± 7.5）,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 Twist1基因可能在食管鳞癌中普遍异常高表达,其与癌组织浸润、淋巴结转移存在一定相关性,对食管鳞癌细胞迁移和侵袭可能有一定影响.