小麦TaCIPK8基因的表达分析及其与TaCBLs的互作

CIPK是植物钙感受器钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。根据拟南芥At CIPK8基因序列,利用同源克隆的方法从抗逆性较强的小麦品种石4185中克隆了一个编码序列全长为1350 bp的蛋白激酶基因Ta CIPK8(Gen Bank号:KJ561804.1)。序列分析表明该基因编码的蛋白含有449个氨基酸,分子量为52.24 k D,理论等电点为7.16,具有CIPKs家族蛋白所特有的N端激酶域和C端NAF/FISL结构域;与拟南芥At CIPK8蛋白序列相似度达83.5%。为进一步研究其功能,采用Real-time PCR方法检测该基因在胁迫条件下的响应情况,发现Ta CIPK8基因受高盐、外源ABA和低温(4℃)胁迫诱导表达。利用植物启动子数据库Plant CARE和PLACE对Ta CIPK8基因启动子序列进行分析,结果显示Ta CIPK8基因启动子存在大量应答脱水胁迫、干旱、低温和ABA的顺式作用元件,也存在一些响应激素GA和茉莉酸甲酯的元件。利用酵母双杂交方法研究Ta CIPK8和Ta CBL家族蛋白的互作,结果显示,共转化含有Ta CIPK8和Ta CBL3基因载体的酵母菌能够在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/Ab A和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Ab A三种培养基上生长,且在后两种培养基上长出蓝色菌落。结果说明Ta CIPK8与Ta CBL3发生了互作,进而引起了报告基因MEL1、AUR1-C、HIS3和ADE2的表达。该研究结果对于研究Ta CIPK8基因的功能以及与CBL蛋白的互作调控网络具有一定的参考作用。

小麦TaCIPK2基因克隆及与TaCBLs蛋白互作分析

以普通六倍体小麦品种德抗961为材料,根据野大麦HbCIPK2的mRNA序列(GenBank序列号JN831652)设计引物,采用同源克隆方法从小麦中克隆TaCIPK2基因(GenBank序列号KU640381),测序结果显示该基因序列全长1421bp,开放阅读框(ORF)1359bp,编码452个氨基酸残基,预测分子量为50.91kD,pI为9.07。氨基酸序列比对结果表明:该基因与HvCIPK2(KP638475.1)、TaCIPK2(KJ561791.1)、HbCIPK2(JN831652.1)的相似度分别为94.69%、96.93%、95.80%,具有高度同源性;系统进化分析表明它们位于相同进化支上,亲缘关系最近。采用Real-timePCR方法分析不同逆境胁迫处理下TaCIPK2基因表达的特异性,200mmol/LNaCl高盐胁迫处理小麦幼苗后根和叶部TaCIPK2基因均上调表达;4℃低温胁迫处理后根部TaCIPK2基因上调表达,而叶部下调表达;100μmol/LABA胁迫处理后根和叶中TaCIPK2均上调表达。为检测TaCIPK2与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL6、TaCBL7的相互作用,构建酵母表达载体pGADT7-TaCIPK2,转化酵母Y187感受态细胞;同理pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6、pGBKT7-TaCBL7转化到酵母细胞Y2Hgold中,都没有出现自激活活性和毒性现象。共转化的二倍体酵母,只有pGADT7-TaCIPK2×pGBKT7-TaCBL2和pGBKT7-53×pGADT7-T在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培养基板上长出的菌落呈现蓝色,说明TaCIPK2能够与TaCBL2相互作用,激活下游报告基因HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2的表达,该研究结果对进一步研究TaCIPK2的功能有一定的指导意义。

小麦TaCIPK3与TaCBLs的互作分析

植物类钙调磷酸酶B蛋白CBLs(Calcineurin B-like proteins)和CBL互作蛋白激酶CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在应答非生物逆境的钙信号系统中起着重要作用。为了研究小麦TaCIPK3的互作调控网络,以普通六倍体小麦(Triticum aestivum)品种矮抗58的叶片c DNA为模板,PCR扩增获得TaCIPK3的编码序列。TaCIPK3基因开放阅读框(ORF)长1348 bp,编码447个氨基酸。生物信息学分析显示TaCIPK3的N-端催化结构域含有CIPK家族蛋白的典型激活环,C-端调节域含有该家族高度保守的24个氨基酸NAF基序,具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的结构特征。利用酵母双杂交体系对TaCIPK3与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL3、TaCBL4、TaCBL6、TaCBL7、TaCBL9进行相互作用鉴定,发现分别转化有p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL1、p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta-CBL2、p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL3和p GADT7-TaCIPK3×p GBKT7-Ta CBL4的二倍体酵母菌能够在二缺培养基SD/-Trp/-Leu平板上长出白色菌落,同时这些二倍体菌株在四缺培养基SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-α-Gal/Ab A上能够长出淡蓝色菌落,表明下游的4个报告基因ADE2、HIS3、MEL1和AUR1-C被激活,因此说明TaCIPK3与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL3和TaCBL4之间存在互作。本研究结果对进一步研究TaCIPK3的生物学功能以及与TaCBLs的互作网络具有一定的参考作用。

小麦逆境胁迫相关基因TaCBL7的克隆、生物信息学及表达特性分析

从小麦抗性相关EST数据库中筛选并获得一条753 bp的核苷酸序列,该序列包含了一个642 bp的开放阅读框,编码一个由213个氨基酸残基组成的蛋白,氨基酸同源性分析发现,该蛋白含有保守的钙结合结构域EF-hand,在其N端含有豆蔻酰化位点MGXXXS/T,与OsCBL7高度同源,属于小麦CBL家族,命名为TaCBL7。实时荧光定量PCR分析表明,TaCBL7基因在苗期的根、茎及叶子,成熟期的根、茎、叶子及种子中均表达,但表达存在差异;该基因表达受盐、干旱、低温、ABA及条锈病诱导调控,表达分析结果表明,TaCBL7基因在小麦发育时间和组织空间上存在表达特异性(即时空表达特异性),同时参与了小麦生物与非生物胁迫的响应。推测TaCBL7基因编码的蛋白在小麦生长发育及胁迫过程中具有重要功能,为进一步研究小麦TaCBL7基因在生长发育和逆境响应过程中的功能,以及利用TaCBL7基因进行小麦分子育种奠定基础。

TaCBL基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达分析

利用实时定量PCR技术对小麦与叶锈菌互作过程中的钙调磷酸酶B类似蛋白相关基因的表达进行了检测分析。结果表明,在亲和组合接种后的16h,TaCBL1、TaCBL3、TaCBL4、TaCBL7基因的相对表达量明显增加,分别达到了对照的近8,2,4.5,14倍的水平,而在不亲和组合中,这4个基因在不同时间点的表达水平与对照相近;TaCBL2和TaCBL9的表达趋势在亲和组合和不亲和组合间大致相似,但在不亲和组合中其表达的峰值出现的时间要早于亲和组合;TaCBL6在2个组合的表达变化基本一致。以上结果初步表明,TaCBL可能参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的基础防卫反应,其中TaCBL2和TaCBL9在抵抗叶锈菌侵染过程中发挥正调控作用,而TaCBL1、TaCBL3、TaCBL4和TaCBL7的高表达削弱了寄主的抗病性从而更利于叶锈菌的侵染。为进一步深入研究Ca2+信号通路中钙调磷酸酶B类基因在小麦与叶锈菌互作过程中的作用机制奠定了试验基础。