TaMyb2-Ⅱ基因在普通小麦(Triticum aestivum L.)及其近缘种中的单核苷酸多态性分析

以39份抗旱性不同的普通小麦、5份A基因组材料、4份拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides)、6份粗山羊草(A.tauschii)和2份四倍体小麦为材料,分析TaMyb2基因的核苷酸序列长度多态性和单核苷酸多态性,及其与抗旱性的关系。结果发现,TaMyb2在A基因组材料中无目标片段扩增,在其他材料中共检测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种类型序列。经详细分析,TaMyb2-Ⅱ序列长1606bp,在供试材料77088bp的核苷酸序列中检测到34个单核苷酸变异,其中26个SNP,8个InDel,二者出现的频率分别为1/2965bp和1/9636bp,编码区π值(0.00055)小于非编码区的π值(0.00185),说明编码区的遗传变异小于非编码区的遗传变异。从SNP水平上分析,发现普通小麦与其D基因组供体种粗山羊草及四倍体小麦的亲缘关系较近,与B基因组供体种拟斯卑尔脱山羊草的亲缘关系较远。48份材料的TaMyb2-Ⅱ序列共分为18个单倍型(haplotype),其中haplotype2、3、5、6、8、9均为旱地栽培的普通小麦品种,说明普通小麦TaMyb2-Ⅱ的这几个haplotype结构可能与抗旱性有关。

干旱胁迫下小麦TaMyb2-Ⅱ基因的表达水平变化研究

为了研究TaMyb2-Ⅱ基因的功能,将不同时间段PEG处理和未进行胁迫处理(CK)小麦叶片总RNA进行了Northern杂交分析。结果表明,TaMyb2-Ⅱ参与了对水分胁迫的应答过程,水分胁迫1 h时,其表达水平较对照有明显提高,水分胁迫12 h到24 h的表达量达到最高,在48 h时其表达量下降到与对照相当的水平。

TaMyb2-Ⅱ的亚细胞定位研究

为了探明TaMyb2-Ⅱ转录因子在细胞中定位的特异性,采用瞬时表达体系,将绿色荧光蛋白基因CFP导入洋葱表皮细胞中,在亚细胞结构水平上研究TaMyb2-Ⅱ转录因子的定位取向。激光共聚焦显微镜观察结果表明,TaMyb2-Ⅱ转录因子主要分布在细胞核中,这为进一步研究该基因的功能及作用途经提供了重要信息。

小麦TaMvb2-Ⅱ基因的克隆

为了研究小麦转录因子基因TaMyb2-Ⅱ的功能,利用SalⅠ和SacⅠ双酶切的方法,构建了基因克隆及表达载体PEBV,获得了正义PEBV-35Sp-TaMyb2-Ⅱ-NOSter阳性克隆,实现了TaMyb2-Ⅱ基因的定向克隆。

小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体的构建与遗传转化

采用双酶切方法构建了小麦TaMyb2基因转化拟南芥表达载体pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅰ-NOSter和pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅱ-NOSter,并通过农杆菌GV3101介导,用渗透法将TaMyb2-Ⅰ和TaMyb2-Ⅱ基因转入拟南芥中.结果表明,TaMyb2-Ⅰ、TaMyb2-Ⅱ和表达载体pCHF3分别被KpnⅠ和PstⅠ成功酶切为837bp、840bp和10.4kb的目标条带;分别将pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅰ-NOSter和pCHF3-35Sp-TaMyb2-Ⅱ-NOSter转入农杆菌GV310l中,在提取的农杆菌质粒DNA中分别扩增出了837bp和840bp目标条带,说明可用于拟南芥的转化;在含Kan(50mg/L)的1/2MS培养基上筛选转基因当代拟南芥植株的种子(T0),获得了T1代抗性植株,转化率约为0.1%.