Tax基因表达细胞系的建立及其生物学活性的初步研究

本研究旨在建立成人T细胞白血病病毒-1(HTLV-1)的tax基因表达细胞系,并对其生物学特性进行初步研究。利用脂质体将真核表达载体pCMV-tax和空载体pCMV-neo-Bam转入T淋巴细胞系(JurkatE 6-1)细胞,用G418筛选出稳定表达tax基因的T细胞系TaxP和表达tax阴性细胞系TaxN。用RT-PCR检测LAT、SLP-76、ZAP-70和NF-κB(p65)mRNA的表达。将pNF-κB-Luc报告基因质粒分别转染入TAX蛋白阳性和空载细胞后,检测细胞内NF-κB的活性。用流式细胞仪检测CD25,CD69分子的表达。结果表明:用G418筛选出稳定转染tax基因的Jurkat细胞株,经检测RNA转录水平获得了tax稳定表达的转染细胞;RT-PCR显示,与TaxN细胞LAT相比TaxP细胞的ZAP-70,SLP-76和NF-κB表达增高(p<0.05);pNF-κB-Luc报告基因检测显示,TaxP细胞中NF-κB的活化程度明显提高(p<0.01);流式细胞仪检测显示,TAX能够促进T细胞表面CD69,CD25分子的表达。结论:建立了tax基因表达细胞系,TAX蛋白能够促进T细胞的活化和激活NF-κB通路。

HTLV-1 Tax基因真核表达载体的构建及对RPE细胞的影响

目的构建人T淋巴细胞白血病病毒-1(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)Tax基因真核表达载体,在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达Tax蛋白,观察其对细胞的影响。方法应用基因重组技术构建重组载体PIRES2-EGFP-Tax(PT),鉴定后将重组载体转染入RPE细胞,应用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测细胞内Tax基因和蛋白的表达;通过MTT和流式细胞仪检测质粒(空白载体、PT和Green-Tax)转染RPE细胞24h和48h后对RPE细胞生长活力及细胞周期的影响。结果经双酶切鉴定和测序分析证实成功地构建了HTLV-1Tax真核表达载体;通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测到转染Tax重组载体的RPE细胞中有Tax基因和蛋白的表达。质粒转染RPE细胞后,细胞生长活力受到抑制,G1期减少而S期增加。但转染Tax质粒和空白载体,对RPE细胞的生长活力和细胞周期产生相似影响。结论成功构建了HTLV-1Tax基因真核表达载体,并在RPE细胞中表达Tax蛋白;Tax质粒对RPE细胞的影响不排除是转染试剂所致。

Tip-1抗体抑制舌癌细胞增殖的作用和机制研究

目的探讨Tip-1单克隆抗体对舌癌细胞增殖的作用及可能机制。方法通过体外培养口腔鳞状细胞癌细胞,Tip-1单克隆抗体干预,采用同型和空白对照干预。台盼蓝染色法检测舌癌细胞活细胞数;westernblotting检测mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt蛋白表达。结果Tip-1抗体干预96h后舌癌活细胞数为(0.13±0.01)×10^6,同型对照组为(0.25±0.00)×10^6,2组相比,差异有统计学意义(P=0.007);Tip-1抗体干预组mTOR、Akt、p-Akt蛋白表达水平明显升高,p-mTOR所有组表达均不明显。结论Tip-1抗体在体外能抑制舌癌细胞增殖,但其机制有待进一步研究。

HTLV-1 Tax蛋白对T细胞中HMGB1调控的影响

目的探讨人T淋巴细胞白血病1型病毒（humanT—cellleukemiavirus1，HTLV-1）Tax蛋白对人高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）基因转录调控的影响。方法提取TaxN和TaxP细胞总RNA和蛋白质，通过real—timePCR和Westernblot分析HMGB1mRNA和蛋白质的表达情况；利用脂质体介导方法，将6个含有不同长度HMGB1调控序列的pGL3-HMGB1-luc瞬时转染至TaxN和TaxP细胞，观察HMGB1基因在不同T细胞中的转录活性；pCMV—Tax与pGL3-HMGB1-luc瞬时共转染至Jurkat细胞，观察Tax蛋白对HMGB1基因的转录调控影响；染色体免疫共沉淀（ChIP）找寻Tax蛋白影响HMGB1基因转录调控的区段。结果TaxP细胞中HMGB1mRNA和蛋白质表达水平高于TaxN细胞。TaxN和TaxP细胞中HMGB1调控趋势基本相似，均表现出3号质粒（pHLuc3，含有-504～＋83HMGB1区段）的相对荧光素酶活性（HMGB1／neo）最高，但是6号质粒（含有-1163-＋83HMGB1区段）却表现出TaxP细胞HMGB1的转录活性明显高于TaxN细胞。pCMV．Tax与pGL3．HMGB1．Luc报告基因共转染到Jurkat细胞也显示，6号质粒（pHLuc6）中Tax促进HMGB1基因的转录。ChIP分析证实了Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163—-1043区段。结论-504—-383可能是HMGB1基因转录激活的关键启动子区，Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段促进HMGB1基因转录。

HTLV-1 Tax蛋白阳性T细胞中EGR-1表达调控机制的研究

目的：探讨成人T淋巴细胞白血病病毒1型（ HTLV-1病毒） Tax蛋白阳性T细胞TaxP中早期生长反应基因-1（EGR-1）表达调控的机制。方法构建不同长度的EGR-1调控序列报告基因，将其转染TaxP细胞，加入NF-κB抑制剂BAY 11-7082或同等体积的二甲基亚砜（DMSO），24 h后收集细胞检测荧光素酶活性；TaxP细胞上清中加入BAY 11-7082或同等体积的DMSO，24 h后免疫印迹检测EGR-1蛋白表达；将Tax及其突变体M22和M47分别转染293 T细胞，24 h后免疫印迹检测EGR-1蛋白表达。结果成功构建了不同长度及突变体的EGR-1调控序列荧光素酶报告基因；荧光素酶报告基因检测显示：相对于E1、E2而言， E3、DelE、MutE的荧光素酶活性明显降低，加入BAY 11-7082后，E1、E2的荧光素酶活性明显降低（P＜0．01），而E3、DelE、MutE无明显变化；同样地，免疫印迹检测显示加入BAY 10-7082后，EGR-1蛋白表达明显降低；相对于野生型和M47，转染M22突变体后，293 T细胞EGR-1蛋白表达明显降低。结论 NF-κB是Tax蛋白阳性T细胞中EGR-1表达调控的关键核因子。

生长激素在人T细胞白血病病毒1型Tax蛋白阳性T细胞中的表达及其对细胞活化的影响

目的探讨成人T细胞白血病病毒1型（adult T cell leukemiavirustypel，HTLV-1）Tax蛋白对T淋巴细胞自身反应性生长激素（growthhormone，GH）表达的影响。方法Westernblot检测Tax阳性细胞（Tax Pcell）和Tax阴性细胞（TaxNcell）中的GH蛋白表达情况；共聚焦显微镜检测GH在两种细胞内的定位情况；RT-PCR检测GHmRNA的表达；脂质体法将pGL2-GH-luc转染TaxN和TaxP，检测GH的转录活性；脂质体法将pNF-KB-luc、pAP-1-luc和pNFAT—luc分别与pcDNA3．0-GH共转染TaxP细胞，检测核转录因子活性。结果与TaxN细胞相比，在TaxP细胞GH的mRNA和蛋白表达明显增高（P〈0．05），pGL2-GH-luc转染细胞后荧光素酶表达明显升高，约6．37倍（P〈0．05）；过表达生长激素可上调TaxP细胞中NF-κB活性1．7倍（P〈0．05）。结论生长激素可能协同NF-κB参与成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia，ATL）的发病。

雷公藤红素抑制成人T细胞白血病细胞增殖及机制

本研究旨在分析雷公藤红素对成人T细胞白血病细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其分子机制。使用不同浓度的雷公藤红素溶液处理多种成人T细胞白血病细胞株,通过四唑盐比色法(MTT)、克隆形成实验检测细胞的增殖情况;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况;最后通过Western blotting及双荧光素酶报告基因技术探究雷公藤红素抑制成人T细胞白血病细胞生长的调控机制。结果表明雷公藤红素能显著抑制成人T细胞白血病细胞增殖并诱导其凋亡,随着雷公藤红素浓度的增加Bax/Bcl-2蛋白比率明显升高,凋亡途径中Caspase-3/7蛋白也随之被切割活化,同时病毒编码的癌蛋白Tax的表达也明显受到抑制。以上结果表明,雷公藤红素通过调控Bcl-2家族蛋白,激活了Caspase途径诱导细胞凋亡,并通过抑制病毒关键蛋白Tax的表达,从而有效抑制了成人T细胞白血病细胞的增殖。该研究为临床应用雷公藤红素治疗成人T细胞白血病提供了实验依据。