伪狂犬病病毒编码的内膜蛋白生物学功能研究进展

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)属于甲型疱疹病毒亚科,能够感染宿主神经系统并在神经元中建立潜伏感染,是威胁全球养猪业的重要病原体。与其他甲型疱疹病毒类似,PRV的病毒粒子存在一层富含蛋白质的内膜层,它通过将含有DNA的核衣壳与布满糖蛋白的囊膜层衔接起来构成病毒粒子的完整结构。研究表明,在PRV的感染周期中,内膜蛋白可以通过单独作用或与其他蛋白相互作用的方式,在维持病毒形态结构的稳定、促进病毒的复制和出核、参与病毒在细胞质中的二次包膜、以及对抗宿主免疫系统等方面发挥重要生物学功能。因此本文重点讨论了近年来PRV内膜蛋白生物学功能的相关研究进展,以期为伪狂犬病病毒的病原学研究以及抗病毒研究提供重要参考。

A Multiple Functional Protein:the Herpes Simplex Virus Type 1 Tegument Protein VP22

The herpes simplex virus type 1(HSV-1) VP22,is one of the most abundant HSV-1 tegument proteins with an average stoichiometry of 2 400 copies per virion and conserved among alphaherpesvirinae. Many functions are attributed to VP22,including nuclear localization,chromatin binding,microtubule binding,induction of microtubule reorganization,intercellular transport,interaction with cellular proteins,such as template activating factor I(TAF-I) and nonmuscle myosin II A(NMIIA) ,and viral proteins including tegument protein VP16,pUS9 and pUL46,glycoprotein E(gE) and gD. Recently,many novel functions performed by the HSV-1 VP22 protein have been shown,including promotion of protein synthesis at late times in infection,accumulation of a subset of viral mRNAs at early times in infection and possible transcriptional regulation function.

大枣红色素的提取及其稳定性

用正交实验对大枣红色素的提取工艺条件进行了筛选,得出最优提取条件为:在80℃下,用16倍于枣皮粉的80%乙醇,超声波浸提30min。同时研究了光照、pH值、H2O2、Na2SO3等因素对色素稳定性的影响,结果表明大枣红色素除在强氧化剂H2O2和碱性环境中稳定性较差外,在其他条件下均具有良好的稳定性。

血吸虫对吡喹酮抗药性的研究Ⅴ 吡喹酮对曼氏血吸虫吡喹酮抗性株和敏感株成虫皮层的损伤

目的 体内比较吡喹酮对曼氏血吸虫吡喹酮抗性株与敏感株成虫皮层的损伤程度。方法 用各虫株尾蚴分别感染小鼠,感染后第57天,以300mg/kg微粒化吡喹酮悬液对小鼠作灌胃治疗;在灌药后10、30min和1、12、24h后剖杀感染小鼠,门静脉灌注收集成虫,按常规方法制成扫描电镜标本,扫描电镜下观察成虫体表的变化。结果 吡喹酮诱导的皮层损伤主要为虫体表形成泡状结构的薄壁隆起;给药10min,敏感株雄虫皮层可见较多小泡状物,而抗性株则少见;1h后,敏感株虫体表可见大量的泡状物,泡状物溃破可形成皮层损伤灶,抗性株仅见少量的泡状物;24h后,敏感株雄虫体表完全受损,部分皮层剥落,暴露出肌肉层,而抗性株仅见少量泡状物和破损的泡状物。给药1h后,敏感株雌虫开始出现少量泡状物,抗性株雌虫体表未见泡状损伤;12h后,敏感株雌虫泡状物数量增加,抗性株仅在有限区域见少量泡状物。结论 抗性株和敏感株成虫体表吡喹酮诱导的皮层损伤程度存在明显差异,敏感株的损伤程度重于抗性株,雄虫重于雌虫。

日本血吸虫极低密度脂蛋白结合蛋白重组抗原的免疫保护性研究

目的探讨日本血吸虫极低密度脂蛋白结合蛋白(SVLBP)重组抗原的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值。方法用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导克隆菌大量表达SVLBP重组抗原,以镍-次氮基三乙酸琼脂糖树脂(Ni-NTA)亲和层析法纯化制备SVLBP重组抗原;将纯化的重组抗原加福氏佐剂经皮下免疫C57BL/6小鼠,每隔2周免疫1次,在第3次免疫后10d,经腹部皮肤攻击感染日本血吸虫尾蚴35±1条,感染后45d剖杀,计数检获虫数和每克肝虫卵数(LEPG)。小鼠在免疫前和攻击感染后分别采眶窦血,用ELISA测定特异性IgG及其亚群抗体水平。结果相对于佐剂对照组,免疫组小鼠的减虫率为33.4%,减卵率为47.6%;免疫后小鼠产生高水平的特异性IgG(>1:6400);抗体亚类检测结果显示,免疫组小鼠IgG2a、IgG2b、IgG1明显高于免疫前和佐剂对照组。结论日本血吸虫皮层蛋白SVLBP重组抗原能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子。

中华绒螯蟹不同生理阶段腹肢的结构变化及粘液腺的发育特征

用显微及亚显微方法研究了中华绒螯蟹雌体不同生理阶段 (幼蟹、未成熟蟹、成熟蟹、抱卵蟹和流产蟹 )腹肢的体壁结构变化和粘液腺发育特征。体壁的上皮细胞层常与粘液腺相连 ,粘液腺分泌物经导管穿过各层角膜排出。不同生理状况下中华绒螯蟹的腹肢体壁各角膜层结构的比例及致密度有明显的差异 ,粘液腺细胞及导管的数量不同 ,粘液腺与上皮细胞的连接程度也不同。粘液腺是否正常分泌、刚毛囊的开闭均与中华绒螯蟹的胚胎附着有关。比较研究发现 ,太湖抱卵蟹腹肢体腔内腺体比温州本地抱卵蟹腹肢内腺体发达 ,分泌的粘液也特别多。分析认为中华绒螯蟹腹肢组织结构。

日本血吸虫童虫表膜结合多肽的亲和筛选与初步鉴定

目的筛选噬菌体十二肽库中与日本血吸虫(Schistosoma japonicum)童虫表膜特异性结合的多肽并鉴定。方法利用噬菌体十二肽库与日本血吸虫活童虫靶分子之间的亲和力结合,经3轮吸附-洗脱-扩增,从末次回收的结合噬菌体中随机挑取20个克隆进行测序。根据测序结果 ,选取出现次数最多的噬菌体克隆作为目标噬菌体,免疫组化检测目的噬菌体,并回输到已感染日本血吸虫的小鼠体内,2.5h后处死小鼠,回收肝脏和日本血吸虫童虫,分别洗脱与肝脏和童虫结合的噬菌体,进行统计学分析。结果经3轮筛选后,噬菌体回收率从第1轮的0.77×10-8到第3轮的0.75×10-5,说明噬菌体得到了有效富集。DNA测序结果表明,20个噬菌体克隆中的15个克隆呈现QHPRIRKOOOOO序列。免疫组化结果显示,表达该序列的噬菌体能与童虫表膜有效结合;体内回输试验证实,该噬菌体能有效地靶向结合于体内日本血吸虫童虫表膜。结论筛选获得的短肽QHPRIRKOOOOO能有效地靶向结合日本血吸虫童虫表膜。

双齿围沙蚕主要器官组织学的研究

采用组织切片法对双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis的组织结构进行了系统观察。结果表明,双齿围沙蚕主要由体壁、疣足、消化系统和排泄系统组成。体壁从内向外分为壁体腔膜、肌肉层、表皮层和角质层,壁体腔膜是一层扁平细胞,肌肉层由环行、纵行和斜行的平滑肌组成,表皮层为单层柱状细胞,其中夹有腺细胞和感觉细胞;疣足的壁与体壁一致,疣足内充满毛细血管、间充质细胞、黏液细胞和血细胞,在性腺发育期间,有大量生殖细胞着生于疣足壁上;消化系统包括消化管和消化腺两部分,消化管为从口到肛门的直管,包括口、口腔、咽、食道、胃和肠,在食道两侧有一对食道腺;排泄系统由肾管构成。

免疫组化技术对斯氏狸殖吸虫成虫免疫诊断相关抗原的初步研究

目的初步分析斯氏狸殖吸虫成虫表膜和肠相关抗原,探讨肺吸虫病的免疫诊断的特异性诊断抗原。方法斯氏狸殖吸虫成虫制备成15μm的冰冻切片,肺吸虫患者血清识别斯氏狸殖吸虫成虫特异性抗原,采用免疫金标记和免疫酶标记检测技术对抗原进行定位,激光共聚焦显微镜技术进行半定量分析以及免疫透射电镜对其细微结构的观察。分实验组和对照组。结果肺吸虫患者血清识别的斯氏狸殖吸虫成虫抗原定位于虫体的表膜和肠腔,表膜抗原半定量分析平均灰度值为80.65,肠腔抗原半定量分析平均灰度值为71.26,电镜下可见胶体金附着于肠腔和表膜的双层结构。结论肺吸虫患者血清识别的斯氏狸殖吸虫成虫抗原都为表膜相关抗原和肠相关抗原,因此与肺吸虫病免疫诊断相关的诊断抗原为虫体表膜和肠上皮产生的相关蛋白。

人DNAJB6蛋白与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的鉴定

pUL23是人巨细胞病毒(HCMV)UL23基因编码的皮层蛋白.HCMV皮层蛋白与病毒颗粒的形成、病毒转移、免疫调控等病毒生活过程相关.利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,获得与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白分子DNAJB6[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily B,member 6].回复酵母双杂交、体外GST-Pull down和免疫共沉淀试验再次确认两者之间的相互作用.该结果为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.

用抗虫体表膜抗原抗体测定犬细粒棘球绦虫粪抗原

利用Echinococcus granulosus(Eg)成虫表膜抗原抗体夹心ELISA方法检测犬细粒棘球绦虫感染的粪抗原。首先提取E g成虫表膜抗原,制备抗E g成虫表膜抗原的血清,然后用间接ELISA和Western blotting方法检测其抗原抗体反应及免疫原性,用间接免疫组化方法对E g成虫表膜蛋白进行组织定位。利用双抗体夹心ELISA方法检测感染E g的犬粪抗原。ELISA结果表明E g成虫表膜抗原具有良好的抗原性并能产生高效价抗体,抗体不与多头绦虫和泡状带绦虫抗原反应;Western blotting结果表明E g成虫表膜抗原与原头蚴、不成熟E g有共同蛋白成分。免疫组化结果证实虫体表膜蛋白分布在虫体表皮。该抗原抗体系统能检测到感染后13d的犬细粒棘球绦虫。结果表明该E g成虫表膜抗原抗体系统可用于诊断犬细粒棘球绦虫感染。

蝎皮蛋白质组分对正常小鼠免疫功能的影响

目的研究蝎皮蛋白质组分对正常小鼠免疫功能的影响,为蝎皮开发利用和发现新的活性物质提供实验依据。方法采用刃天青和M TT法检测蝎皮水溶性总蛋白(STP)、总角蛋白(STKP)及水溶性蛋白组分Ⅱ(STPⅡ)对正常小鼠T、B淋巴细胞转化、NK细胞杀伤活性的作用。结果STP和STKP ig给药后,小鼠脾T淋巴细胞增殖反应高于正常对照组,但只有STP小剂量组与对照组比较差异显著(P<0.001)。B淋巴细胞增殖反应结果显示STKP大、小剂量均可加强增殖反应,与对照组比较差异极显著(P<0.05、0.01)。STP和STKP大、小剂量组NK细胞杀伤活性与对照组相比有升高趋势。STPⅡ两个剂量组100、200 m g/kg ig给药均能明显抑制正常小鼠T、B淋巴细胞增殖反应,与对照组相比差异极显著。STPⅡ大剂量组NK细胞杀伤活性与对照组相比有降低趋势,但无统计学意义。结论STP和STKP具有一定的提高免疫功能的作用,STPⅡ则具有抑制免疫功能的活性。揭示蝎皮蛋白质组分具有免疫调节药理活性,值得深入研究。

程氏东毕吸虫成虫体表扫描电镜观察

目的 描述程氏东毕吸虫体表扫描电镜 (SEM)显微结构。方法 成虫虫体采自自然感染的绵羊 ,经 2 5 %戊二醛固定、扫描前将虫体用 1%锇酸固定、经酒精梯度脱水、溅射喷涂金膜处理 ,最后以日立JSM - 80 0扫描电镜观察并摄片。结果 雄虫体表满布皮层皱褶及感觉球 ,雌虫前、中部体表较光滑 ,后部体表上有一定数量的棘和感觉球 ,但无带孔皮层增厚块。结论 SEM结果分析 :雄虫体表感觉球为程氏东毕吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫的共同体表特征 ,但感觉球数量及分布不尽相同 ,雌虫尾部也有棘和感觉球 ,但无带孔皮层增厚块 ,支持程氏东毕吸虫为一独立种。

东方次睾吸虫成虫体被扫描电镜研究

目的了解东方次睾吸虫体被的超微形态学特征。方法采用扫描电镜技术对实验感染猫获得东方次睾吸虫的成虫背、腹面依次连续观察。结果体表履盖体棘,腹吸盘之前体棘以螺旋式规律排列成行并向体后倾斜,体棘混生型,以分簇排列,体前部分布密集,其间距自前往后逐渐稀疏。感觉乳突4种类型,包括无感觉圆丘型大乳突、具感觉毛大乳突,以及具感觉毛的中、小型乳突。虫体表面为一定规律的凹凸状,呈现不同部位的皮式结构。结论该虫体被着生不同类型的棘和感觉器,头、颈部特征最为丰富,显示了本吸虫形态结构特征与其寄生生活相适应,在分类学上也有一定意义。

日本血吸虫脱尾童虫表膜结合短肽的筛选与鉴定

目的筛选噬菌体十二肽库中与日本血吸虫(Shistosoma japonicum)脱尾童虫表膜特异性结合而不与尾蚴表膜结合的短肽并鉴定。方法利用M13噬菌体十二肽库,经体外逆向差异筛选日本血吸虫尾蚴和脱尾活童虫,从第3轮回收的结合噬菌体中随机挑取15个克隆进行测序获取目标噬菌体后,采用ELISA法、洗脱回收率实验(以M13KE为阴性对照)和免疫组织化学法检测日本血吸虫脱尾童虫、尾蚴与噬菌斑克隆的特异性结合。荧光显微镜观察人工合成的阳性噬菌体短肽与日本血吸虫脱尾童虫体外的特异性结合。构建目的片段pEGFP-C2质粒体外转染日本血吸虫脱尾童虫。结果经3轮逆向差异筛选后.噬菌体回收率从第1轮的3.50×10^(-5)%到第3轮的3.20×10^(-2)%,富集度明显提高。DNA测序结果表明,15个噬菌体克隆分别含有ZL6、ZL4和ZL1等3个不同的短肽序列。ELISA结果显示,M13噬菌体短肽ZL4(MppZL4)、MppZL6和MppZL1分别与脱尾童虫膜蛋白结合后的P/N值为6.72,3.65和2.22,分别与尾蚴膜蛋白结合后的P/N值为1.58,5.15和1.20。洗脱回收率实验结果显示.MppZL4与脱尾童虫洗脱回收率[(4.60±0.27)×10^(-2)%]远高于MppZL6[(2.10±0.23)×10^(-3)%]、MppZL1[(1.20±0.28)×10^(-3)%]和M13KE[(1.30±0.60)×10^(-7)%)(P<0.01)。免疫组化结果显示,日本血吸虫脱尾童虫与MppZL4特异性结合.阳性率为83.0%(83/100)。荧光显微镜检测结果显示,人工合成的RhB-ZL4可与日本血吸虫脱尾童虫体外特异性结合。构建的ZL4/pEGFP-C2质粒体外可成功转染日本血吸虫脱尾童虫。结论筛选获得的短肽ZL4能与日本血吸虫童虫表膜特异性结合.不与尾蚴表膜结合。

蝎皮蛋白质组分的提取分离及体外活性成分筛选

目的:为了证明蝎皮对免疫功能的影响并探讨蝎皮中含有的活性成分,通过提取分离蝎皮中的水溶蛋白质和角蛋白质组分,经过体外药理活性筛选,观察其对细胞或体液免疫系统的影响,以期获得具有生物活性的蛋白质组分。方法:采用水提与盐析法获得水溶性总蛋白(ST1),还原法获得总角蛋白(ST2),通过Sephadex G-50凝胶色谱对水溶总蛋白和总角蛋白进行分离,并对获得的各种蛋白组分进行了体外药理筛选。结果:发现蝎皮的蛋白质组分在体外药理实验中显示对T/B淋巴细胞转化具有显著促进作用,但对NK活性无明显作用。结论:蝎皮蛋白提取组分具有一定的免疫调节生物活性,研究结果对蛋白质药物开发提供了基础数据。

血吸虫体被的结构功能及其蛋白质组研究

血吸虫体表由一层合抱体细胞组成,称为体被。体被在血吸虫的营养吸收和免疫逃避等方面发挥重要作用,也被认为是诊断、疫苗和药物的潜在靶点。近年来兴起的体被蛋白质组研究,迄今已发现和鉴定了一大批体被蛋白,这将为血吸虫病的预防控制提供重要线索。

日本血吸虫重组22kD表膜蛋白免疫水牛的效果观察

目的 用重组日本血吸虫 2 2 k D表膜蛋白 (r Sj2 2 )免疫水牛 ,检测特异性 Ig G抗体的应答水平 ,并观察抗血吸虫的保护效果。方法 用抗原 (r Sj2 2 )加佐剂 (Quil- A)肌肉注射免疫水牛 ,以10 0 0条日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,感染后 5 5 d剖杀 ,计算减虫和减卵率。用免疫印斑和 EL ISA方法测定抗体反应。结果 免疫组每头牛血清均能特异地识别 r Sj2 2 k D抗原和成虫抗原中的 2 2 k D分子 ,特异性 Ig G抗体滴度达 1:2 5 6 0 0。与 Quil- A对照组相比 ,减虫率仅 8.5 % ,肝卵 EPG减少12 .3% ,粪卵 EPG减少 2 6 .8% ,但均无统计学意义。结论 用 r Sj2 2 k D抗原免疫水牛诱导的特异性Ig

华支睾吸虫表膜相关抗原重组表达载体的构建

目的 通过筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因 ,并构建 2 0 8kDa华支睾吸虫表膜相关抗原(CSTA2 0 8)重组表达载体 ,为进一步研究其功能及其应用奠定基础。方法 对华支睾吸虫cDNA文库进行筛选 ,通过NCBI和ExPasy网站的Blast程序进行序列比对 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifscan、NCBIConservedDo mainSearch等程序对其进行结构域分析。将所发现的华支睾吸虫表膜相关抗原基因编码区定向克隆到原核及真核表达载体PGEX - 4T - 1和PcDNA3上 ,构建的PGEX - 4T - 1-CSTA2 0 8、PcDNA3-CSTA2 0 8重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。结果 发现华支睾吸虫表膜相关抗原基因 ,完整阅读框含 5 5 5个碱基 ,编码 184个氨基酸 ,理论分子量为 2 0 8kDa ,理论pI为 4 33。序列分析表明 ,华支睾吸虫CSTA2 0 8编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,CSTA2 0 8具有完整的钙结合蛋白保守功能域。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。结论 发现华支睾吸虫表膜相关抗原基因 。

橙皮中橙皮苷的微波法提取工艺研究

采用微波法探讨橙皮中提取物的抗氧化效果,通过正交实验对提取橙皮苷的工艺条件进行优化。结果表明:固液比1∶20,80%的乙醇水溶液为溶剂、在微波火力80 W下提取时间60s时清除率最高。