甘南牦牛三种消化道线虫多重PCR检测方法的建立及流行病学调查

为建立一种能同时检测奥氏奥斯特线虫、捻转血矛线虫和环纹背带线虫的多重PCR检测方法,掌握三种线虫在甘南牦牛中的流行情况,本研究以三种线虫的核糖体ITS序列为靶标设计3对特异性引物,建立了多重PCR检测方法,同时检测986份甘南牦牛粪便样品,对三种线虫进行流行病学分析。结果显示,本研究建立的多重PCR方法检测到奥氏奥斯特线虫、捻转血矛线虫、环纹背带线虫DNA的最低浓度分别为0.03、0.03、0.02 ng/μL,三种线虫的感染率分别为12.58%、14.30%、11.36%,混合感染率为12.98%。1—4月份3种消化道线虫的感染率显著高于5—8月份和9—12月份(P<0.01),3种消化道线虫的感染率在0~3岁与大于3岁的牦牛之间差异不显著。本研究成功建立了用于牦牛奥氏奥斯特线虫、捻转血矛线虫、环纹背带线虫的多重PCR检测方法;甘南牦牛三种线虫的流行率较高,提示甘南牦牛消化道线虫的防控不能忽视。

基于ITS序列鉴别3种感染白牦牛线虫的PCR-RFLP方法的建立

目的基于内转录间隔区(ITS)序列,建立鉴别3种感染白牦牛线虫的PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。方法将从甘肃省天祝藏族自治县1头白牦牛小肠中分离的12条线虫进行消化并提取DNA,PCR扩增ITS序列并送测序,测序结果在GenBank数据库进行同源性分析。用DNAstar7.1软件分析序列之间的差异,用邻接(NJ)法构建系统进化树。根据序列选择特异的酶切位点,对PCR产物分别进行酶切反应,建立PCR-RFLP方法。结果 12条线虫均扩增出长度约900 bp的ITS序列片段,与预期结果一致。测序结果同源性分析显示,其中3种各4条分别与已报道的肿孔古柏线虫(Cooperia oncophora,GenBank登录号为AB534601)、环纹背带线虫(Teladorsagia circumcincta,GenBank登录号为JF680984)、奥斯特线虫(Ostertagia sp.,Gen Bank登录号为HQ844228)的序列相似性高于99%。ITS序列比较发现,3种线虫种间差异为4.3%~13.9%,种内差异均低于1%。其中肿孔古柏线虫与奥斯特线虫的ITS序列差异最大,为13.6%~13.9%;肿孔古柏线虫与环纹背带线虫ITS序列差异为12.9%~13.1%;环纹背带线虫和奥斯特线虫ITS序列的差异最小,为4.3%~4.8%。系统进化树结果显示,3种线虫被分为明显的3支,且环纹背带线虫和奥斯特线虫有更近的亲缘性。ITS序列酶切结果显示,NdeⅠ酶可将环背带线虫和肿孔古柏线虫的ITS序列酶切成约650 bp和250 bp的片段,Eco RⅤ酶仅将肿孔古柏线虫酶切成约700 bp和200 bp的片段,2种内切酶均不能酶切奥斯特线虫的ITS序列。结论建立的基于ITS序列的PCR-RFLP方法可鉴别感染白牦牛的肿孔古柏线虫、环纹背带线虫、奥斯特线虫。