西番莲中夜来香花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus, TeMV)是对西番莲危害较大的一种病毒病原。根据病毒末端结合蛋白(VPg)序列设计引物,建立了以Vpg-334F/506R为特异性引物,退火温度54℃,引物浓度0.6μmol/L的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性扩增TeMV基因组6 483~6 675 nt区域,所得标准曲线扩增效率为10^(2).77%,决定系数为0.996 1,最低检测浓度为2.370×10^(2)拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的1 000倍。应用该方法对接种TeMV的西番莲进行检测,发现接种3 d后可在叶片中检测到TeMV,定量分析不同温度下TeMV在叶片中的积累,发现26~28℃下病毒积累速度最快,且植株症状表现与病毒积累量密切相关。对赣南地区采集的76份西番莲田间样品进行检测,共检出71份阳性样品,检出率为93.4%。综上,本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,适于TeMV的快速检测。

西番莲TeMV和CMV双重RT-PCR检测体系的建立及应用

【目的】建立西番莲夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的双重RT-PCR检测体系。【方法】根据TeMV和CMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因序列,分别设计两对特异性引物,并对引物组合浓度、退火温度和循环次数进行优化。【结果】优化结果显示:TeMV和CMV最佳引物组合浓度分别为2.0 mmol·L^-1和8.0 mmol·L^-1;最佳退火温度为57 ℃;最佳循环次数为35次。【结论】灵敏度分析结果显示,在样品cDNA原液稀释到10^-5时,仍能检测到两种病毒扩增出的目的条带。同时,以健康组培苗作为对照组,应用建立的双重RT-PCR检测技术对采集于福建省不同产地的36份西番莲样品进行了病毒检测,发现有8 份样品同时感染两种病毒,8份样品仅感染TeMV,10份样品仅感染CMV。本研究可为西番莲TeMV和CMV的检测提供便利。

侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法;序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对,同时对获得的CP基因序列采用Mr Bayes软件的贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现,一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用抗体反应呈阳性;电镜观察结果表明,该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子;Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段,克隆、测序获得长度为680 bp的序列,该序列与已报道的Te MV核苷酸序列一致性最高(98.2%)。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp(命名为BXGFJ-13分离物),与已报道的Te MV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明,13个Te MV分离物共形成3个类群,相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物(KJ789129)先以较高的后验概率聚为一个分支,再与泰国2个分离物(AM409188、AM409187)聚为第2类群(Group II),表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物Te MV-CPf/Te MV-CPr建立的RT-PCR方法,具有良好的特异性,仅能从感染Te MV的西番莲样品上扩增出目的片段,而从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,Bt MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示,该方法能从稀释102倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准,同时结合血清学检测、电镜观察结果,证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有Te MV;建立的特异性RT-PCR方法能够用于Te MV的快速检测。

西番莲病毒可视化多重RT-LAMP检测技术的建立

东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)、夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是当前危害我国西番莲的主要病毒种类。为建立同时快速检测西番莲上EAPV、TeMV和CMV的可视化多重逆转录环介导等温核酸扩增(Multiplex reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,multiplex RT-LAMP)技术,本研究根据GenBank已报道的EAPV、TeMV和CMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列保守区域分别设计、筛选特异性引物,并通过反应体系和反应条件的优化,建立了可同时快速检测EAPV、TeMV和CMV的多重RT-LAMP技术,并进行了特异性、灵敏度测定及西番莲果园样品的检测。结果表明,建立的多重RT-LAMP方法特异性良好,可对EAPV、TeMV和CMV同时进行检测,而与西番莲上其他病毒及阴性对照无交叉反应;多重RT-LAMP的灵敏度最低可检测稀释至145×10-3 ng/μL总RNA,与一步法RT-PCR方法的灵敏度相当;西番莲果园样品3种病毒的多重RT-LAMP检测结果与一步法RT-PCR检测结果一致。本研究建立的多重RT-LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,适用于基层实验室和现场对西番莲上EAPV、TeMV和CMV的快速初筛。

广西局地西番莲病毒病的病原鉴定及优势病毒分析

在广西采集表现斑驳、花叶症状疑似病毒病的西番莲叶片样品,利用小RNA测序技术,结合生物信息学分析,鉴定侵染西番莲的病毒种类。参考测序结果采用DAS-ELISA和RT-PCR方法对2015~2018年间采集的385份疑似病毒病样品进行检测,分析引发广西西番莲病毒病的优势病毒种类。结果显示:小RNA共获得20921061 clean reads,拼接获得560个contigs,其中99个contigs被注释为夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV),97个contigs被注释为黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV),69个contigs被注释为东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV),12个contigs被注释为大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)。提取送测序的同批样品叶片的总RNA进行RT-PCR验证,可检测出TeMV、EAPV和CMV 3种病毒,未检出SMV。采用DAS-ELISA和RT-PCR对采集的样品进行检测,结果发现284份样品为阳性样品,检出率为73.76%,其中TeMV的检出率最高为64.16%,其次为EAPV和CMV,检出率分别为41.30%和11.43%;3种病毒存在复合侵染现象,其中TeMV+EAPV的检出率最高为24.94%,TeMV+CMV的检出率为4.16%,EAPV+CMV的检出率为0.26%,3种病毒复合侵染的检出率为4.94%。

侵染云南鸡蛋果的病毒种类鉴定及CMV cp基因序列分析

鸡蛋果(Passiflora edulis)别名百香果、紫果西番莲,为西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora)多年生草质藤本植物,原产于安的列斯群岛^([1])。鸡蛋果营养价值高、风味独特,是一种天然饮料作物。云南独特的地理气候条件,适宜鸡蛋果种植。1990年西双版纳开始集约化种植鸡蛋果(现大多称为百香果)^([2])。近年来鸡蛋果产业在云南发展迅速,但病毒病和根腐病等病害逐渐成为鸡蛋果产业发展的限制因素之一^([2])。

西番莲夜来香花叶病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的建立

根据西番莲上发生的夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因设计引物和探针,将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了一种快速检测TeMV的方法,对该检测方法中的反应时间、温度、探针浓度、引物浓度进行了优化,并检测了该方法的特异性和灵敏度。试验结果表明,RT-RPA-LFD检测体系的最佳反应条件是温度37℃、反应时间13 min、探针浓度5μmol·L^(-1)、引物浓度10μmol·L^(-1)。该方法能够特异性检测TeMV,对含有TeMV cp质粒DNA的最低检测限度为5.125×10^(-4)ng·μL^(-1),比普通PCR检测灵敏10000倍。该方法灵敏度高、特异性强,能够用于田间西番莲样品的检测。