山羊BST-2基因的表达及其亚细胞定位

将山羊的BST-2基因(Capra hircus bone marrow stromal antigen 2 gene)分别克隆至原核表达载体p GEX-4T-1和真核表达载体p3×Flag-CMV-14中,获得了重组表达质粒p GEX-BST-2和p3×Flag-BST-2。将重组质粒p GEX-BST-2转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot结果显示,诱导表达的重组蛋白分子量约为42 ku,与预期蛋白一致。利用脂质体介导转染法将重组质粒p3×Flag-BST-2转染Vero细胞,经激光共聚焦显微镜检测,结果显示,BST-2蛋白在细胞中可以良好表达,并主要定位于细胞膜上。

恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性及其对蛋白结构和功能的影响

目的筛查恒河猴BST-2基因编码区单核苷酸多态性(coding-region single nucleotide polymorphism,c SNP),研究其对蛋白结构和功能的影响。方法提取恒河猴外周血RNA,RT-PCR扩增,单克隆测序比对,确定猴BST-2的c SNP位点;通过蛋白质结构分析软件对蛋白结构进行分析;比较不同基因型猴体内SHIVSF162 p 3复制水平的差异。结果序列比对发现8个非同义突变位点;经Psipred软件预测,其中G41A、T128C、C129和A333C c SNP位点可影响BST-2蛋白二级结构。在SHIVSF162 p 3感染平台期,参考基因型猴(DLQ)病毒复制水平要高于GLQ型猴(P<0.05),其他基因型猴之间无显著差异。结论 c SNP(G41A)可能影响BST-2的抗病毒功能,这为后续研究提供参考信息。

梅花鹿BST-2真核表达质粒的构建和表达

为研究梅花鹿BST-2蛋白的生物学功能,使用特异性引物扩增梅花鹿BST-2基因,构建真核表达载体并表达,利用生物信息学软件对梅花鹿BST-2序列进行分子特性分析。结果表明,梅花鹿BST-2基因CDS区为480 bp,编码159个氨基酸,其氨基酸序列与人,马、牛、羊、猪等物种BST-2氨基酸序列同源性分别为37. 8%、30. 1%、67. 3%、74. 2%和53. 1%。梅花鹿BST-2蛋白含有两个跨膜结构,胞外段具有两个潜在的糖基化位点和三个潜在的二聚化位点。构建真核表达质粒,在其胞外段插入HA标签,转染293T细胞发现梅花鹿BST-2蛋白能在细胞中正确表达,并且可定位在细胞膜上。对其潜在的糖基化位点进行突变可见糖基化现象减弱。本研究为今后进一步研究梅花鹿BST-2蛋白的抗病毒机制奠定了基础。

LC3C通过非经典自噬途径促进Vpu介导的拮抗BST2/tetherin限制HIV-1释放的作用

骨髓间质抗原2（bone marrow stromal antigen 2,BST2）/tetherin是包膜病毒的限制因子,可阻断病毒颗粒的释放。HIV-1编码拮抗这种先天屏障的蛋白质,包括辅助蛋白Vpu。在此基础上,Madjo等研究HIV-1 Vpu是否通过操控自噬通路和（或）ATG蛋白而避免BST2对病毒释放的限制。他们发现,BST2和Vpu存在于LC3阳性的区域。Vpu通过Vpu L63VEM66序列选择性地与ATG8直系同源物LC3C相互作用,且这一序列对Vpu拮抗BST2限制是必需的.

宿主蛋白BST-2抑制非洲猪瘟病毒体外复制的研究

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高致死率传染病。骨髓基质细胞抗原2(BST-2,也称为Tetherin/HM1.24/CD317)被鉴定为一种抑制包膜病毒释放的新型宿主限制因子,它可以将病毒颗粒结合到细胞表面,随后在溶酶体中进行内化和降解,从而抑制病毒复制。因此,它对宿主的抗病毒作用十分重要。本实验室前期研究表明,怀孕猪血清会促进ASFV的复制。ITRAQ分析表明,BST-2蛋白属于下调前十的蛋白之一。为探究宿主蛋白BST-2与ASFV复制之间的关系,本试验通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对BST-2表达的影响;构建并合成了BST-2真核表达质粒以及siRNA干扰序列,通过RT-qPCR、Western-blot去探究外源过表达BST-2及敲低BST-2对ASFV体外复制的调控作用。结果显示,外源过表达BST-2显著抑制了ASFV的复制,敲低BST-2促进了ASFV的复制。本研究通过对BST-2进行过表达和敲低,证实了BST-2作为一种宿主抗病毒分子能抑制ASFV的体外复制,为进一步深入研究宿主蛋白抗ASFV功能提供了新的途径,也为ASF的防控提供了新思路。

骨髓基质细胞抗原2抑制乙肝病毒复制与释放

目的研究骨髓基质细胞抗原2(bone marrow stromal antigen 2,BST-2)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制与释放的影响。方法以不同浓度干扰素处理人肝癌细胞株Hep G2.2.15,Western blot和荧光定量PCR检测BST-2蛋白水平和RNA水平;分别用构建的BST-2真核表达质粒p CDNA3.1-BST2-FLAG和BST-2拮抗蛋白HIV Vpu真核表达质粒,转染Hep G2.2.15细胞,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养液乙肝病毒表面抗原(HBs Ag)和乙肝病毒e抗原(HBe Ag),荧光定量PCR检测HBV mRNA,Southern blot检测HBV DNA。结果转染p CDNA3.1-BST2-FLAG后,HBV mRNA降低26%,细胞内HBV DNA降低31%,细胞培养液中HBV DNA降低33%(P<0.05),细胞培养液中HBs Ag下降至82%,HBe Ag下降至77%(P<0.05);加入Vpu蛋白后,BST-2的抑制作用受到对抗,HBV mRNA恢复至92%,细胞内HBV DNA恢复至93%,细胞培养液中HBV DNA升至98%,细胞培养液中HBs Ag恢复至102%,HBe Ag恢复至99%,HBV复制与释放明显增强。结论 BST-2对HBV复制与释放具有抑制作用,该抑制作用可被HIV Vpu蛋白拮抗。

骨髓基质细胞抗原2在原发性舍格伦综合征中的表达及意义

目的:检测骨髓基质细胞抗原2 (bone marrow stromal antigen-2,BST-2)在原发性舍格伦综合征(primary Sj觟gren's syndrome,pSS)患者唇腺及外周血淋巴细胞中的表达,探讨BST-2对淋巴细胞增殖的作用,以期为原发性舍格伦综合征的发病机制研究及药物治疗靶点的开发提供理论基础。方法:应用实时定量PCR技术检测30例pSS患者及30例对照患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和唇腺组织中BST-2的表达水平,并与临床指标进行相关性分析。采用免疫组织化学对唇腺组织中的BST-2进行定位及半定量分析。通过分选外周血中的淋巴细胞,实时定量PCR明确BST-2异常表达的淋巴细胞亚群,唇腺免疫组织化学连续切片染色验证。慢病毒转染人B淋巴细胞系以过表达BST-2,CCK8检测BST-2对细胞增殖活性的影响,流式细胞术分析其对细胞凋亡的影响。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与对照患者相比,pSS患者唇腺组织中BST-2表达升高,阳性细胞主要是浸润腺体的B淋巴细胞。同时,p SS患者外周血CD19+B细胞BST-2与对照组相比表达升高。过表达B细胞中的BST-2可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:BST-2在p SS患者外周血及唇腺组织中表达升高,BST-2主要定位于B淋巴细胞。推测BST-2通过促进B细胞在腺体中的增殖和浸润,从而参与pSS的发生与发展。

猪BST-2全基因克隆、真核表达载体构建及组织表达谱分析

为研究猪BST-2基因的生物学功能,用特异性的引物扩增猪BST-2基因,并利用生物信息学软件对猪BST-2基因及氨基酸进行分子特性分析,同时进行了猪BST-2蛋白的真核表达及组织表达谱分析。结果表明:猪BST-2基因全长851bp,其中5′-UTR为23bp,3′-UTR为294bp,CDS区为534bp,编码177个氨基酸,猪源BST-2蛋白氨基酸序列与大猩猩、仓鼠、家鼠、驴、猫、牛、猕猴、绵羊、人BST-2蛋白氨基酸序列同源性分别为46.1%,41.7%,39.5%,35.4%,42.0%,40.5%,44.4%,38.7%,46.8%。含有2个跨膜结构(27~49aa和154~176aa),2个潜在的糖基化位点,14个潜在的磷酸化位点,包含磷酸激酶ATM、CKⅡ、PKA、PKC的结合位点。构建真核质粒并转染发现猪BST-2蛋白能够在Vero细胞内正确表达。半定量PCR检测发现BST-2基因在所有组织中均有表达,尤其是在免疫组织及器官(淋巴结、胸腺、扁桃体、脾)、大肠、小肠中的表达量较高。本试验为今后进一步分析验证猪BST-2蛋白的抗病毒机制奠定了基础。

绵羊BST-2B基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了表达含有绵羊BST-2B(o BST-2B)基因的重组蛋白,用RT-PCR方法扩增绵羊肺细胞的o BST-2B基因,并将其克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组表达质粒p GEX-4T-o BST-2B。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组o BST-2B蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备抗o BST-2B的多克隆抗体。蛋白免疫印迹分析和间接免疫荧光试验检测结果显示,该抗体具有较好的反应原性。本试验成功制备的o BST-2B蛋白及多克隆抗体,为研究o BST-2B蛋白的生物学功能及羊传染病的致病机制提供了良好的基础材料。

BST-2和Vpu相互作用抑制剂筛选模型的建立

骨髓基质细胞抗原2(Bone marrow stromal cell antigen 2,BST-2,又称Tetherin、CD317、HM1.24)是宿主先天性免疫应答的组成部分,可抑制人类免疫缺陷病毒1(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)的释放,HIV-1的辅助蛋白Vpu可通过跨膜区与BST-2的跨膜区产生相互作用,进而将其降解,下调其在细胞表面的数量,拮抗BST-2的抗病毒功能。本研究将海肾荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc)与BST-2的N端连接,增强型黄色荧光蛋白(Enhanced yellow fluorescent protein,EYFP)与Vpu的C端连接,分别构建质粒RB和VE,使两种融合蛋白在细胞内共表达,产生生物发光共振能量转移(Bioluninescence resonance energy transfer,BRET)信号,进而建立稳定双表达细胞系,以BST-2和Vpu的跨膜区相互作用为靶点,应用BRET技术,建立两种蛋白相互作用抑制剂的筛选模型,以期通过BRET信号变化筛选出相互作用抑制剂,发展新型的艾滋病治疗手段。

宿主抗病毒因子BST-2抑制HBV释放的研究进展

BST-2(Bone marrow stromal antigen 2,BST-2)一种宿主内天然抗病毒因子,自2008年首次报道其具有抗人类免疫缺陷病毒(HIV-1)释放的功能,一直认为BST-2主要在细胞膜上限制病毒释放。最近发现BST-2对在细胞内部组装的乙型肝炎病毒(HBV),同样具有抑制作用,扩大了BST-2抗病毒作用的范围。并且BST-2在多囊泡体(MVB)中抑制HBV的释放与抑制HIV-1在细胞膜中释放的作用机制相似。同时发现HBV能够拮抗BST-2的限制作用,而HBV病毒中发挥作用的拮抗因子,目前有两个观点,一是HBV在肝细胞的特定条件下利用调节蛋白HBx拮抗BST-2的限制作用,另一观点认为包膜蛋白HBs对BST-2存在拮抗作用。本文重点概述和讨论了BST-2限制HBV病毒的最新研究进展。

BST-2抑制HIV-1病毒样颗粒释放的研究

BST-2是最近发现的可以抑制成熟HIV-1(human immunodeficiency virus,HIV)病毒颗粒从哺乳动物细胞表面释放的宿主因子,随之发现其也可以抑制多种包膜病毒的释放。本研究采用密码子优化的表达HIV-1 gag和gag-pol蛋白的质粒所形成的病毒样颗粒作为研究对象,观测BST-2对这两种病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的释放抑制情况及其作用机制。结果发现,瞬时表达和稳定表达的BST-2均可以显著抑制病毒样颗粒从哺乳动物细胞释放,同时发现这两种病毒样颗粒(gag/gag-pol)的释放都可以被BST-2抑制;而且,HIV-1中Vpu蛋白可以拮抗BST-2抑制HIV病毒样颗粒释放的作用,另外,通过化学试剂和酶学方法处理,确证BST-2可以被包装进病毒样颗粒中。

HIV-1 Vpu拮抗人类Tetherin的研究进展

人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1,HIV-1)是艾滋病(AIDS)的主要病原,逆转录病毒和其他有包膜病毒颗粒的释放因人体细胞的阻止而产生抗病毒效应,但此效应能被HIV-1辅助蛋白Vpu所拮抗。Vpu蛋白变异或其功能受到抑制,HIV-1病毒颗粒的产生会明显减少。

束缚蛋白抗HIV机制

束缚蛋白(tetherin)是一种具有特殊功能的蛋白质,它可抑制包膜病毒从感染细胞中释放。研究发现,人的束缚蛋白可将新生的HIV-1病毒颗粒固定在细胞表面,同时,它还可以减小HIV-1子代病毒的传染性。本文将主要从分子结构、抗HIV-1病毒的作用机制和在HIV传播中的作用三方面来阐述束缚蛋白抗病毒作用的最新研究进展。