植物TFⅢA类型锌指蛋白的研究进展

锌指蛋白作为一种转录调控因子,在植物的生长发育中起着重要作用.近年来,在克隆植物锌指蛋白基因方面取得了很大进展,特别是对于植物TFⅢA类型锌指蛋白的研究.目前已经获得了近30个TFⅢA类型锌指蛋白的基因克隆.已发现的TFⅢA锌指蛋白参与了一些重要过程的调控,如:形态建成、雄配子产生、胚的发育、胁迫反应等.

重组TFAR19蛋白对鼻咽癌CNE-1细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响

目的研究重组TFAR19(TF-1cellapoptsis-relatedgene19)蛋白对鼻咽癌细胞株CNE-1端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达的影响,探讨重组TFAR19蛋白促CNE-1细胞凋亡的作用机制。方法将不同浓度的高纯度重组TFAR19蛋白分别和人类鼻咽癌细胞株CNE-1共同培养后,通过7-AAD及AnnexinV-PE标记进行流式细胞术分析,检测TFAR19蛋白对细胞的促凋亡效应;RT-PCR法比较试验组和对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA的表达水平;TRAP-银染法检测重组TFAR19蛋白作用下CNE-1细胞株端粒酶活性的改变。结果(1)一定浓度的TFAR19蛋白在未加载体的情况下,可促进细胞凋亡,加入5、10、15、20、30mg/L的TFAR19蛋白后,CNE-1细胞的凋亡率分别是15.26%,29.48%,37·11%,54·20%,72.36%。阳性对照组(凋亡诱导剂stuanrosporin处理)与阴性对照组(PBS处理)的细胞凋亡率分别是98·37%、13·40%。(2)试验组与对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA表达无显著差异。(3)与20mg/L以上浓度的重组TFAR19蛋白共同培养后,CNE-1细胞株端粒酶活性明显降低。结论重组TFAR19蛋白在较高浓度下可降低鼻咽癌细胞株CNE-1的端粒酶活性,明显促进肿瘤细胞凋亡。

靶向转录因子的抗肿瘤药物研发进展

转录因子(transcription factor,TF)通过与DNA链上特定结合位点的结合,转录调控信号通路中不同蛋白的表达,进而参与调控多种细胞的正常生理过程,如细胞增殖、代谢、凋亡、免疫反应和分化等。TFs的异常表达促进了肿瘤的发生发展,以TFs为靶点成为药物研发的新思路。然而,结构紊乱和结合口袋的缺乏使得靶向TFs的药物设计具有挑战性。本综述将总结靶向TFs的小分子药物开发研究进展以及一些已经取得成功的案例,以证明靶向TFs成药的可行性。

乌桕SsSAD基因的原核表达与纯化研究

乌桕是一种重要的木本油料树种。SAD(stearoyl-acyl ACP desaturase)是油料植物中将饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸的一种关键脱氢酶。为了进一步揭示乌桕SsSAD的功能,该研究在大肠杆菌中表达了该蛋白。结果表明:(1)通过RT-PCR的方法从乌桕种子中克隆出了SsSAD基因编码区全长序列,并将其克隆到低温诱导的原核表达载体pCold TF上,构建原核重组表达载体pCold TF/SsSAD,转化大肠杆菌BL 21star(DE3)并获得原核表达工程菌株。(2)通过IPTG法低温诱导表达融合蛋白。该重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,融合蛋白分子质量约为101kD,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了重组蛋白,上述结果为进一步研究乌桕SsSAD的结构和功能奠定了基础。

人TRAIL cDNA的真核表达和体外肿瘤细胞的凋亡诱导作用

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ TRAIL）全长 cDNA及其胞外区真核表达产物体外诱导肿瘤细胞的凋亡作用，为 TRAIL基因治疗提供实验依据。方法 从胎心 cDNA文库中经 PCR扩增获得两种形式 cDNAs，构建相应的真核表达载体后进行基因转染，并筛选得到稳定表达细胞株；收集表达上清进行肿瘤细胞的体外凋亡诱导，同时观察凋亡相关蛋白 TFAR19与表达上清共同存在时对肿瘤细胞的作用。结果 成功获得表达两种目的蛋白的真核细胞系，其表达上清均能诱导肿瘤细胞 HeLa和 Hec-1a的凋亡，而且 TFAR19能增强表达上清的凋亡诱导作用。结论 证明 TRAIL基因的真核表达产物同样能诱导肿瘤细胞凋亡，如有 TFAR19存在则效果更佳。

小尾寒羊血清转铁蛋白多态性与其生长性状的关系

采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对85只小尾寒羊在转铁蛋白(Tf)位点上的6个生长性状进行了研究.结果表明:Tf位点检出了8种基因型TfAA、TfBB、TfCC、TfAB、TfAC、TfBC、TfCD、TfAD,受4个等位基因TfA、TfB、TfC、TfD控制,其中TfC为优势基因;羊只的6个表型性状在血清转铁蛋白位点的不同基因型之间存在一定的差异,除在体重和体长位点上TfCC型显著大于TfBB型外(P<0.05),其余4个性状均表现为弱相关.据此认为,TfCC型可作为小尾寒羊体重和体长两生长性状早期选种的辅助标记.

甘蓝型油菜BnCOP1基因的原核表达和纯化

COP1蛋白是植物光信号调节网络中介导光信号转导的一个关键因子,对植物生长发育起重要调控作用.通过RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆BnCOP1基因编码区全长序列,并将其连接到冷诱导原核表达载体pCold TF上,构建原核重组表达载体pCold TF/BnCOP1,转化大肠杆菌BL(21)star.通过IPTG法低温诱导表达融合蛋白.结果表明,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子质量约为128 kD,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了高纯度的重组蛋白,这些结果为进一步研究油菜BnCOP1的结构和功能奠定了基础.

黑羽品系吐鲁番鸡血清转铁蛋白多态性的研究

用垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定了黑羽品系吐鲁番鸡血清转铁蛋白的多态性。结果表明 :黑羽品系吐鲁番鸡转铁蛋白可以分离出 6～ 9条带 ,受 A,B,C三个共显性等位基因的控制 ,常见表型 AB和 AC型 ,并且雄性与雌性之间有差异。

重铬酸钾对大鼠睾丸支持细胞中雄激素结合蛋白、转铁蛋白和抑制素蛋白表达的影响

目的:研究重铬酸钾对大鼠睾丸支持细胞中雄激素结合蛋白(ABP)、转铁蛋白(Tf)和抑制素(INH)蛋白的表达的影响。方法:建立大鼠睾丸支持细胞体外原代培养模型,分为0mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L重铬酸钾染毒组,Westernblot法检测重铬酸钾作用24h后各组睾丸支持细胞中ABP、Tf和INH蛋白表达水平的变化。结果:ABP蛋白的表达量随重铬酸钾浓度的升高而升高(0.39±0.19、0.51±0.18及0.81±0.19),差异有统计学意义(F=10.738,P<0.001);Tf蛋白的表达量也随重铬酸钾浓度的升高而增加(0.56±0.19、1.21±0.19及1.19±0.17),差异有统计学意义(F=32.435,P<0.001);而INH蛋白表达却呈下降趋势(1.06±0.19、1.20±0.19及0.71±0.19),差异有统计学意义(F=14.116,P<0.001)。结论:重铬酸钾能够引起大鼠睾丸支持细胞分泌功能的变化,产生生殖毒性作用。

考马斯亮蓝R250斑点法检测猪脾转移因子分离液中蛋白的研究

考马斯亮蓝 (CBBR2 50 )斑点法检测猪脾转移因子分离液中蛋白 ,以牛血清白蛋白 (BSA)作阳性对照 ,结果显示该方法灵敏度高、操作简便 ,耗时短 。

非洲猪瘟病毒截短p54蛋白的原核表达与纯化

旨在高效表达可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白。去除可能影响p54蛋白可溶性表达的前50个氨基酸(aa),根据GenBank收录的ASFV p54基因序列设计引物,从第51个aa对应的基因序列起用PCR扩增截短的p54基因,并用分子克隆方法插入到带有TF及His标签的冷休克表达载体pCold TF上,构建pCold TF-p54重组质粒。经菌液PCR及测序验证后将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达p54重组截短蛋白,对IPTG诱导浓度、诱导时间进行优化,并对纯化重组蛋白时所用洗脱液的咪唑浓度进行探索。Western blot鉴定p54重组截短蛋白的反应原性,并探究TF标签对于该蛋白反应原性的影响。结果表明,成功构建了pCold TF-p54重组质粒,经终浓度为1 mmol/L的IPTG于16℃诱导9 h时,p54重组截短蛋白的表达量最高,分子质量约为76 ku。经50 mmol/L咪唑洗脱液洗脱可得到较纯的p54重组截短蛋白,经人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV)3C Protease切除TF及His标签后,再次纯化可得到无标签且高纯度的p54截短蛋白。Western blot结果显示无标签的p54截短蛋白及有标签的p54重组截短蛋白均可被ASFV p54单克隆抗体特异性识别,均具有反应原性,且p54重组截短蛋白还可被ASFV阳性血清特异性识别。研究证实了原核表达的p54重组截短蛋白兼具可溶性、良好的反应原性,且重组蛋白上的TF标签不影响抗体对p54蛋白的识别,因此可用于后续ASFV抗体检测方法的研发。

铁跨膜转运蛋白与脑神经疾病的相关性研究进展

铁是人体内必不可少的微量元素,细胞的氧化代谢及免疫应答、红细胞的生成等都有铁元素的参与[1]。人体可以利用两种形式的铁,非血红素铁和血红素铁。通过文献归纳、整理,我们率先总结出铁在体内细胞转运的工作模式：＂两个中心,三个体系,网络调控。

基于蛋白质结构域特异性的关键蛋白质识别算法

关键蛋白质的识别对于理解细胞的生长调控过程、疾病研究和药物设计等方面具有重要的意义。随着高通量技术的发展,越来越多的蛋白质相互作用数据被获取,使得可以从网络水平上研究关键蛋白质。目前,许多基于蛋白质网络拓扑特征的算法被提出,但是这类方法忽略了蛋白质网络的生物信息和假阴性、假阳性数据的影响。因此,论文通过结合蛋白质结构域和蛋白质网络的拓扑特征提出了一种新的算法Do-ECC。实验结果表明,Do-ECC明显优于其他8种算法(D C,BC,CC,SC,EC,IC,LAC,NC)。

藤茶总黄酮通过调控TGF-β1/p38MAPK通路对肝纤维化大鼠的作用及机制研究

目的探讨藤茶总黄酮(TF)通过调控转化生长因子β1/p38-促分裂原活化蛋白激酶(TGF-β1/p38MAPK)通路对肝纤维化大鼠的作用及机制。方法65只Wistar大鼠,随机分为5组,对照组(灌胃生理盐水)、模型组(灌胃生理盐水)、藤茶总黄酮低剂量组(灌胃75 mg/kg)、藤茶总黄酮高剂量组(灌胃300 mg/kg)、激动剂组(灌胃300 mg/kg藤茶总黄酮加腹腔注射2 mg/kg anisomycin),每组13只,除对照组外,余组采用皮下注射25%CCl4建立肺纤维化模型,给予相应药物干预5周。检测5组血清ALT、AST、肝组织ColⅠ、ColⅢ水平,HE染色观察肝组织病理改变,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肝组织中TGF-β1、p38MAPK、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA相对表达量,Western blot法检测肝组织中TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9蛋白相对表达量。结果与模型组比较,藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组及激动剂组血清ALT、AST及肝组织ColⅠ、ColⅢ水平均降低,其中藤茶总黄酮高剂量组ALT、AST、ColⅠ低于藤茶总黄酮低剂量组和激动剂组(P<0.05)。HE染色结果显示模型组肝组织结缔严重,肝脏明显纤维化,藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组、激动剂组肝纤维化程度明显减轻,其中藤茶总黄酮高剂量组肝脏恢复程度最佳。与模型组比较,藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组及激动机组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白相对表达量均降低,p-p38MAPK蛋白相对表达量降低,MMP-9 mRNA和蛋白相对表达量均升高(P<0.05),其中藤茶总黄酮高剂量组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白相对表达量及p-p38MAPK蛋白相对表达量均低于藤茶总黄酮低剂量组及激动剂组,MMP-9 mRNA和蛋白相对表达量均高于藤茶总黄酮低剂量组及激动剂组(P<0.05)。结论藤茶总黄酮可显著抑制大鼠肝纤维化,其调控机制可能与TGF-β1/p38MAPK信号通路有关。

转录因子的入核转运调控机制

转录因子(transcription factors,TFs)参与细胞内DNA转录的起始与调控,直接或间接响应信号通路转导。其中,部分转录因子存在细胞核质定位的改变,在细胞质与细胞核中发挥不同的功能或活性。目前已发现,Smad,细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK),Yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP),β-联蛋白(β-catenin),信号传导与转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)等转录因子存在细胞核质定位的改变。各转录因子通过不同的核定位信号肽(nuclear localization signal,NLS)受经典或非经典入核转运机制调控,进而影响其功能与活性。转录因子入核转运调控作为信号通路调控基因表达的重要方式之一,诸多转录因子入核转运机制仍不清楚。同时,部分转录因子被报道受不同的入核转运机制调控,各入核转运调控机制之间的关系尚不清楚。本文主要针对Smad,ERK,YAP,β-联蛋白,STAT五类转录因子NLS,入核转运机制研究及其对信号通路的影响进行综述,并对转录因子入核转运机制中存在的问题进行讨论,以期为后续其他转录因子入核转运机制研究提供参考。

基于TIGA_S4VM改进算法的蛋白质序列识别方法

针对安全的半监督支持向量机(safe semi-supervised support vector machine,S4VM)存在参数选择盲目性、正负样本比例不平衡等问题,建立了基于改进的TF-IDF(term frequency-inverse document frequency,TF-IDF)、遗传算法(genetic algorithm,GA)和S4VM的蛋白质序列识别方法 TIGA-S4VM。利用改进的TF-IDF算法提取出蛋白质序列中的特征项,将各个特征项在蛋白质序列中出现的频率归一化后作为识别模型的特征值,并结合GA以及S4VM对蛋白质序列进行识别。实验结果表明,TIGA-S4VM优于其它5个识别方法,即使在训练样本率较低时,也能有效地识别蛋白质序列。

C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物制备方法的比较

目的对C群脑膜炎球菌多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)蛋白结合物的5种制备方法进行比较。方法以GCMP作为多糖抗原,破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)和重组绿脓杆菌外毒素A(recombinant exoprotein A from Pseudomonas aeruginosa,r EPA)作为载体蛋白,采用5种结合路线制备7种结合物,并对其生化指标、免疫原性及磷酸铝佐剂的免疫增强效果进行检测。结果不同的结合方法均可将不同载体蛋白与多糖有效结合,在小鼠体内均具有良好的免疫原性。7种结合物的分子大小分布、游离多糖含量、多糖/蛋白值、回收率及免疫原性等指标有较大差异;采用相同结合方法,以TT和r EPA作为载体蛋白制备的结合物的生化指标及免疫原性无差异;磷酸铝佐剂可显著提高结合物的免疫原性。结论在选择GCMP蛋白结合物制备方法时应综合考虑原料多糖的化学结构、载体蛋白类型、结合路线、结合物纯化方法、质量控制方法和剂型等因素。本实验为GCMP蛋白结合物制备路线的选择提供了实验依据。