弓形虫TgERP基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为原核表达弓形虫的TgERP基因,参照GenBank中弓形虫GTl株的TgERP基因序列设计引物,通过PCR扩增分离的一株猫源弓形虫(TC株)的TgERP基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,通过IPTG诱导表达蛋白,应用带His标签的重力柱纯化蛋白,采用BCA方法测定蛋白浓度,利用重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果成功表达了TgERP蛋白,且蛋白以上清形式表达,相对分子质量约16 ku。将纯化的重组蛋白pET-28-TgERP作为诊断抗原,初步建立了间接ELISA方法;利用间接ELISA、改良凝集试验(MAT)和间接血凝试验(IHA)3种方法分别检测472份羊、犬、猫血清样品,发现阳性率分别为1.0%、3.8%、3.4%,验证了建立的间接ELISA方法可区分动物感染弓形虫的途径。本研究为弓形虫病快速诊断方法的建立和疫苗的研发奠定了基础。

弓形虫胚层发育相关蛋白基因的克隆和序列分析

目的对15个弓形虫虫株的弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）基因进行克隆和序列分析，了解其变异和进化情况，为评价该蛋白在血清学诊断和疫苗防疫应用上的价值提供理论基础。方法设计TgERP基因的PCR引物，对15个弓形虫虫株进行PCR扩增和序列测定，测序结果利用Puzzle 5．2、Paup 4．0和DNAStar5．0软件进行分析。结果TgERP基因包含的完整开放阅读框（ORF）长度均为315bp，A＋T含量在46．67％～46．98％之间，仅有1个碱基发生变异，变异率为0％～0．32％。编码104个氨基酸，变异率在0％～0．96％之间。系统进化分析显示，TgERP基因序列虽然能够将弓形虫Ⅰ型虫株与Ⅱ／Ⅲ型虫株区分开，但却不能区分所有基因型的虫株。结论TgERP基因在各基因型虫株中十分保守，不适合作为遗传标记分子来区分不同基因型的弓形虫虫株。