弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆、表达及鉴定弓形虫(RH株)微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因,为建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,与克隆载体pGEM-T连接,经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后,亚克隆入表达载体pBK-CMV,IPTG诱导表达pBK-TgMIC10阳性重组子转化宿主菌E.coliBL21,Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了一597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-TgMIC10、pBK-TgMIC10分别作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,表明Tg-MIC10基因的克隆和亚克隆均获成功,用IPTG诱导带有重组质粒pBK-TgMIC10的大肠杆菌,产物行SDS-PAGE,可得到一约21kDa融合蛋白,Western-blot法鉴定该蛋白能被弓形虫感染的兔血清所识别。

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆和序列分析

目的从弓形虫RH株cDNA中扩增出微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因并进行克隆,为利用其表达的重组蛋白建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实。结果PCR法扩增出了一个大小约597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-TgMIC10作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,对插入片断的测序结果表明,TgMIC10具有一个长度为597bp的完整开放阅读框(ORF),编码198个氨基酸,理论分子量23kDa,与GenBank收录(编号为AF293654)的弓形虫Tg-MIC10基因具有高度的同源性(99.5%)。结论本实验成功地克隆了TgMIC10编码基因,为进一步研究提供了条件。