抗副溶血弧菌TLH蛋白多克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测法的研究

目的分别制备抗副溶血弧菌及其不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)的多克隆抗体,建立检测副溶血弧菌TLH的酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法。方法以副溶血弧菌及其TLH分别免疫健康雄性新西兰大白兔和雌性BALB/C小鼠,制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体及小鼠抗TLH多克隆抗体,以间接ELISA法检测两种抗体效价,并以棋盘法筛选两种多克隆抗体用于夹心检测TLH的效价。结果兔抗副溶血弧菌多克隆抗体效价达1∶6400,鼠抗TLH多克隆抗体效价为1∶102 400,经筛选确定以1∶800稀释的兔抗副溶血弧菌多克隆抗体包被酶标板,与1∶1600稀释的鼠抗TLH抗体建立了ELISA双抗体夹心法。结论兔抗副溶血弧菌多克隆抗体可与TLH呈特异性反应,以此建立的双抗体夹心法检测副溶血弧菌TLH可获较满意结果,此实验可为进一步建立简便、快速的副溶血弧菌检测方法奠定基础。

基于TLH重组蛋白单抗的磁性免疫层析试纸条构建

为了检测不耐热溶血毒素TLH,以His-TLH重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备TLH单克隆抗体,然后将纯化后的单抗与磁珠偶联制备免疫磁珠,以此免疫磁珠为标记物构建了TLH重组蛋白的磁性免疫层析检测试纸条。结果表明,该磁性免疫层析试纸条实现了TLH重组蛋白的快速定性和定量检测,具有快速、操作简便、灵敏度高(检测限12.5 ng/mL)等特点。本研究所构建的磁性免疫层析试纸条为重组溶血毒素的快速鉴定、诊断和检测提供了一种新途径。

副溶血性弧菌不耐热溶血素的生物信息学分析与分子动力学模拟

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性人畜共患致病菌,可引发人类胃肠炎等食源性疾病。副溶血性弧菌具有多种毒力因子,热不稳定溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)即是其中之一。该研究对副溶血性弧菌的tlh基因进行了克隆及测序,对tlh基因编码的TLH蛋白进行了生物信息学分析及结构和功能预测。结果表明,TLH蛋白由418个氨基酸组成,预测分子质量为47.36 kDa。在TLH蛋白中确定了几个保守的结构域和基序,包括SGNH水解酶结构域和GDSL基序;对TLH蛋白的三维结构进行了同源建模及验证,在此基础上通过分子动力学模拟分析其稳定性、与4-硝基苯基月桂酸酯(p-nitrophenylaurate,PNPL)的相互作用能力及结合底物对结构紧密度和残基灵活性的影响,揭示了催化三联体Ser153-His390-Asp393周边是一个重要的药物靶点活性口袋,具有高度保守的残基序列,并在底物结合后表现出残基灵活性差异。该研究分析了副溶血性弧菌TLH蛋白的性质和结构,可以为保障水产品的安全性、提高水产品原料安全评价水平提供理论支持。

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90fg和24cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1小时即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。

坎氏弧菌热不稳定溶血素基因的克隆表达、蛋白纯化及其活性

坎氏弧菌(Vibrio campbellii)是水产养殖动物的重要致病菌。本研究构建了坎氏弧菌热不稳定溶血素(TLH)基因的重组表达质粒pET26b(+)/tlh,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸的TLH融合蛋白,然后利用Ni琼脂糖亲和层析柱进行纯化。SDS-PAGE分析显示,该溶血素能够大量表达,分子量约为42kD。纯化的TLH(0.41mg/mL)具有较强的溶血活性(溶血圈直径为16mm)及磷脂酶活性(晕圈直径为15mm)。其溶血活力的最适温度为37℃,在75℃下培养30min即丧失活力;最适pH为6,pH大于或小于6时都会导致其稳定性下降;一价金属离子如Na+、K+对溶血活性几乎没有影响,而部分二价金属离子如Ca2+、Co2+会导致溶血活性降低。本研究结果对阐明坎氏弧菌的致病机理及基因工程疫苗开发有重要意义。

融合表达的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素包涵体复性的研究

目的构建融合表达载体,获得具有生物活性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。方法克隆tlh基因,构建表达载体pET32a+/tlh,融合表达副溶血弧菌不耐热性溶血毒素,用8 mol/L的尿素溶解包涵体,亲和层析纯化目的蛋白,采取逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂等复性方法。结果复性蛋白具有溶血活性及免疫原性。结论通过克隆tlh基因,构建融合表达载体pET32a+-tlh,采取纯化、复性方法,获得具有融血活性及免疫原性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。

双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用

目的建立同时检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因的双重聚合酶链式反应(PCR)法。方法根据副溶血性弧菌的tlh、tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定稳定性、重复性、特异性及灵敏度。结果本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269 bp的片段,而对其它种类的菌物无特异性扩增,结果表明该方法特异性好,双重PCR检测灵敏度为100 cfu/ml。并进行了肛门拭子样品的检测。结论初步建立能在8 h内快速、灵敏、特异地检出副溶血性弧菌毒力菌株的双重PCR技术。

副溶血性弧菌实时重组酶聚合酶扩增检测技术研究

目的建立快速检测副溶血性弧菌的实时重组酶聚合酶扩增技术(RPA)。方法根据副溶血性弧菌tlh基因保守序列设计筛选引物及探针,建立检测副溶血性弧菌的实时RPA方法。通过检测不同浓度副溶血性弧菌标准株DNA模板评价方法灵敏度,通过检测不同种属弧菌及其他细菌标准株评价方法特异度,通过重复试验评价方法稳定性,通过实样检测评价方法应用效果。结果建立的实时RPA方法在39℃恒温下20min内完成副溶血性弧菌扩增,最低检测限为5pg/反应,与其他致病菌无交叉反应,不同浓度的副溶血性弧菌DNA模板和大肠杆菌DNA模板隔日3次实时RPA检测结果一致,实时RPA对51份鲜活/冰鲜鱼、虾、贝、蟹类样品的检测结果与GB4789.7—2013《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》检测结果一致。结论建立的实时RPA方法可定性检测副溶血性弧菌,且实验操作及结果判读简单,适用于突发公共卫生事件、食品安全监管中的副溶血性弧菌快速检测。

应用多重实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌及其毒力基因

目的应用多重实时荧光PCR方法检测113株食物中毒副溶血性弧菌分离株多种毒力基因携带情况。方法用水煮法提取菌株DNA后,利用四重实时荧光PCR方法对DNA同时进行4种基因的检测。结果所有的菌株均携带tlh基因,96株菌株（84.96%）携带tdh基因,9株菌株（7.96%）携带trh基因及62株菌株（54.87%）携带orf8基因的菌株同时tdh基因检测为阳性,无同时携带trh基因和orf8基因的菌株。trh、tdh基因和orf8基因阳性的菌株分布在O1-O4血清群。结论本市大部分食物中毒菌株携带除tlh基因外的1种或1种以上的毒力基因,一半以上的菌株为大流行株;四重实时荧光PCR方法可以同时鉴定和检测副溶血性弧菌及毒力基因,建议作为食源性暴发事件的常规检测方法,获得更快速、准确、完整的结果。