TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞杀伤的体外实验研究

目的:探讨脂质体介导的TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞的杀伤作用以及所产生的旁观者效应。方法:脂质体介导TK基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞,倒置荧光显微镜观察细胞转染是否成功,流式细胞仪检测转染细胞与未转染细胞的转染效率。将未转染的骨肉瘤MG-63细胞分为3组,实验1组用转染TK/GCV的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;实验2组用0.22μm滤器过滤的转染后的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;对照组用培养液培养,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分别测定各组细胞的生长抑制率及骨肉瘤细胞对TK/GCV系统的敏感性。结果:经TK基因转染的MG-63细胞,倒置荧光显微镜下有大量绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染TK基因的细胞转染效率可达75.5%。6 d后MTT检测结果显示实验1组中各比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比有统计学意义(P<0.05);实验2组中1/10、1/7比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。经TK基因转染的MG-63细胞随GCV浓度增加,细胞凋亡率增加。结论:脂质体介导的TK/GCV系统能够通过旁观者效应抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长。

TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究

目的观察胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果,并结合研究结果进行作用机理的分析。方法采用培养细胞移植法,将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将32只裸鼠随机分为4组:空白对照组,TK/GCV治疗组,CD/5-Fc治疗组,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组,每组8只。TK/GCV+CD/5-Fc采用逆转录病毒介导,采用瘤体内直接注射法,同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标,比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响。结果各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制,治疗后各组体积数增加(P<0.05),治疗组裸鼠存活期显著延长,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组效果最好,疗效q值=1.675>1.15,即TK/GCV、CD/5-Fc有交互协同作用。结论TK/GCV与CD/5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用,TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统效果更强。

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达(英文)

目的 构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法 采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果 PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论 AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。

PGK驱动逆转录病毒载体介导HSV-TK／GCV控制GVHD的研究

目的：研究磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子驱动的逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK／GCV）系统在小鼠异基因骨髓移植（allo-BMT）后能否减轻移植物抗宿主病（GVHD）。方法：将转HSV-TK基因的逆转录病毒感染供鼠（C57BL/6鼠）脾淋巴细胞，感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植给Coγ7射线照射后的受鼠（BALB／c鼠）。移植后腹腔注射GCV，用药1周，按移植后首次给药时间，分为GCV0d组、GCV7d组、GCV12d组。观察移植后受鼠生存期、存活率、GVHD发生率及严重程度、T细胞免疫重建（CD3、CD4、CD8）及异基因嵌合等指标。结果：TK／GCV0d组、TK／GCV7d组小鼠平均生存时间分别为（26.90±4.88）d、（27.00±4.80）d，较TK／GCV12d组（21.504±3.26）d和移植对照组（15.10±O.43）d明显延长（P〈0.05），TK／GCV0d组与TK／GCV7d组之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。对照组小鼠12～14d100％发生Ⅲ～Ⅳ级GVHD，实验组死亡小鼠有Ⅱ～Ⅳ级GVHD病理学改变，而长期生存小鼠仅出现Ⅰ～Ⅱ级GVHD。TK／GCV0d组、TK/Gcv7d组、TK／GCV12d组在移植后5、10、15d3个时间点检测CD4^＋ T细胞均高于对照组（P〈0.05），CD8^＋ T细胞均低于对照组（P〈0.05）。移植后30d检测10只受鼠异基因嵌合率均在95％～100％。结论：PGK启动子驱动的逆转录病毒载体介导HSV-TK／GCV系统能有效控制小鼠allo-BMT后GVHD，移植后早期预防性用药效果优于发生GVHD后治疗性用药。

TK/GCV系统联合顺铂对骨肉瘤MG-63细胞生长的抑制作用研究

目的研究脂质体介导的包含TK基因的质粒pIRES-EGFP-tk在GCV作用下(TK/GCV系统)联合化疗药物顺铂对人骨肉瘤MG-63细胞生长的抑制作用。方法构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,制备和转化感受态大肠杆菌BL21及鉴定测序,培养和转染人骨肉瘤MG-63细胞株,流式细胞仪分析和荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态,筛选稳定细胞系,MTT法检测GCV与不同浓度顺铂联合应用对骨肉瘤MG-63细胞株生长的抑制作用。结果成功构建含TK基因cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-tk,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒位点和大小均符合实验设计。将重组质粒pIRES-EGFP-tk转染入人骨肉瘤MG-63细胞株,获得稳定表达。荧光显微镜下观察MG-63(tk+)呈现绿色荧光。流式细胞仪检测转染率为67.7%。通过MTT法检测,当GCV浓度为10μg/ml时,骨肉瘤MG-63(tk+)细胞株的生长受到抑制,同时测得顺铂的最低有效浓度为1μg/ml。当顺铂与GCV(5μg/m1)联合应用时,顺铂的有效浓度可降为0.25μg/ml,并对MG-63(tk+)细胞株有明显的抑制作用。结论 TK/GCV系统联合顺铂可对人骨肉瘤MG-63细胞的生长产生抑制作用,并提高MG-63细胞对顺铂的敏感性,降低其有效剂量。可望为骨肉瘤的辅助治疗提供实验依据。