GHRHR-SV1抗体的制备及其蛋白在黑色素瘤细胞中的表达

目的:制备生长激素释放激素受体剪接变异体1(GHRHR-SV1)抗体,并检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况,为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法:设计GHRHR-SV1基因序列,将其插入质粒pET-32a(+)中,构建pET-GHRHR-SV1重组载体,经PCR及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0mmol·L^(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG);诱导1、2、4和6h,并在37℃、30℃和25℃不同温度下进行诱导;观察目的蛋白表达的最佳IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白,将纯化后的蛋白免疫家兔,制备兔多克隆抗体,ELISA法检测该抗体效价,Western blotting法检测GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系B16-F10中的表达情况。结果:重组载体pET-GHRHR-SV1构建成功。在IPTG浓度为2.0mmol·L^(-1)时目的蛋白的表达量最高;IPTG诱导蛋白表达2h时,蛋白表达量最大;当温度为25℃时,蛋白的表达量最大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后纯度为80%,GHRHR-SV1抗体效价为1∶1 600 000,B16-F10细胞中有GHRHR-SV1蛋白表达。结论:成功制备pETGHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在IPTG浓度为2.0mmol·L^(-1)、诱导时间为2h和温度为25℃的条件下表达最佳。成功制备了高效价的GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有GHRHR-SV1蛋白表达。

人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达

目的构建人生长激素释放激素变异受体1型(GHRHR-SVT1)基因绿色荧光蛋白真核表达载体1(pEG-FP-N1)并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1/GHRHR-SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组:非转染组(对照组),只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组(pEGFP-N1组),加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组(pEGFP-N1/GHRHR-SVT1组),加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果(1)pGEFP-N1/GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切产生约1 080 bp和4 700 bp 2条带。(2)构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR-SVT1原始序列(AF-282259)进行对比,第54位碱基突变(A突变为T),为无义突变。(3)重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组(P<0.01)。(4)重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组(P<0.01)。结论在适当浓度GHRH(10μmol/L)的培养基中,GHRHR-SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。

人生长激素释放激素受体剪接变异体1型对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

目的:探讨人生长激素释放激素受体剪接变异体1型(GHRHR SV1)对肝癌细胞系HepG2增殖的影响,阐明GHRHR SV1对人肿瘤细胞的促增殖作用。方法:将GHRHR SV1真核表达载体导入HepG2细胞建立HepG2-SV1细胞系。设计对照组(野生型HepG2)、空载质粒组(HepG2-pCDNA 3.0细胞系)和干扰组(HepG2-SV1细胞系)。采用PCR和Western blotting法鉴定HepG2-SV1细胞系,CCK-8法检测各组细胞的增殖率,克隆形成实验检测各组细胞的单克隆形成率,细胞划痕实验检测细胞的迁移率。结果:PCR与Western blotting法检测,构建的HepG2-SV1细胞系能稳定表达GHRHR SV1;CCK-8法检测,干扰组HepG2-SV1细胞系的增殖率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05);克隆形成实验,干扰组HepG2-SV1细胞系的单克隆形成率约为空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系的3.5倍(P<0.05);细胞划痕实验,所构建的干扰组HepG2-SV1细胞系的迁移率高于空载质粒组HepG2-pcDNA3.0细胞系(P<0.05)。结论:GHRHR SV1能促进HepG2细胞的增殖。

前列腺癌组织中雄激素受体剪接变异体7表达对转移性前列腺癌患者激素敏感时间的预测作用

目的 探讨前列腺癌组织中雄激素受体剪接变异体7（AR-V7）的表达对转移性前列腺癌患者激素敏感时间的预测作用.方法 回顾性收集2002年1月至2010年6月经前列腺穿刺活检确诊的113例晚期转移性前列腺癌患者的临床病理资料.确诊时年龄43 ～ 84岁,中位年龄70岁.确诊时血清PSA值3.0～6 006.2 μg/L,中位值120.0 μg/L.临床分期M1a期5例（4.4％）,M1b期94例（83.2％）,M1.期14例（12.4％）.患者均接受内分泌治疗.利用免疫组化技术和鼠抗人AR-V7特异性抗体检测前列腺癌组织中AR-V7的表达.利用Cox比例风险模型分析患者确诊年龄、确诊PSA值、确诊Gleason评分、临床分期、内分泌治疗过程中PSA最低值、到达PSA最低值时间以及PSA半衰期对激素敏感时间的预测作用.采用Kaplan-Meier法分析AR-V7的表达对激素敏感时间的影响,并用Log-rank法对结果进行显著性检验.结果 本组患者内分泌治疗过程中PSA最低值为0.0～143.0tμg/L,中位值0.7μg/L.到达PSA最低值的时间为0.9～71.0个月,中位时间8.1个月.PSA半衰期为0.1～41.0个月,中位值1.0个月.经过中位27（2～132）个月的随访后,100例患者进展至去势抵抗性前列腺癌,中位激素敏感时间为24（2～ 132）个月.113例前列腺癌组织中,23例（20.4％）阳性表达AR-V7.Cox多因素分析结果显示,前列腺癌组织中AR-V7的表达（P=0.004,HR=2.223）和内分泌治疗过程中PSA最低值（P=0.035,HR=1.011）是晚期转移性前列腺癌患者激素敏感时间的独立预测因素.前列腺癌组织中表达AR-V7和不表达AR-V7组患者的中位激素敏感时间分别为（16.0±3.4）和（30.0±6.0）个月,差异有统计学意义（P=0.001）.结论 前列腺癌组织中AR-V7的表达和内分泌治疗过程中PSA最低值为晚期转移性前列腺癌患者激素敏感时间的独立预测因素.AR-V7可能为晚期前列腺癌的治疗新靶点.

促甲状腺激素β剪接变体在自身免疫性甲状腺炎小鼠甲状腺中的表达

目的探讨促甲状腺激素（TSH）β剪接变体在甲状腺球蛋白（强）免疫诱发的自身免疫性甲状腺炎小鼠甲状腺中的表达及碘过量对表达的影响，了解TSHβ剪接变体是否参与了自身免疫性甲状腺炎发生的病理过程。方法选7～8周龄的BALB／c小鼠48只，雌雄各24只，体质量20—25g。根据小鼠的体质量和性别，采用随机数字表法分为4组，每组12只，雌雄各半。对照组：饮去离子水；免疫（TG）组：饮去离子水，每只小鼠在8周龄时注射0．1mgTg皮下免疫，分别在11周龄和15周龄时各加强免疫1次；高碘（HI）组：饮用0．05％碘化钠（NaI）水；联合（TG＋HI）组：饮0．05％NaI水，免疫同TG组。喂养8周后处死小鼠，采集外周血，通过化学免疫发光法测量血清中总甲状腺素和游离甲状腺素（TT4、FT4）、总三碘甲腺原氨酸和游离三碘甲腺原氨酸（TT3、FT3）水平；取小鼠甲状腺，冰冻切片后用于HE染色，光镜下观察甲状腺细胞形态改变。SYBRGreen荧光实时定量（RT）-PCR检测TSHβ剪接变体表达。结果肉眼下，与对照组比较，HI组和TG＋HI组小鼠甲状腺明显肿大，颜色暗红。光镜下，对照组小鼠甲状腺滤泡大小较一致，上皮细胞多呈立方形，滤泡腔内含丰富胶质，无淋巴细胞浸润；TG组甲状腺滤泡较一致，上皮细胞立方形，可见单个散在淋巴细胞；HI组可见甲状腺滤泡胶质蓄积性扩张，上皮细胞呈低立方状或扁平状，但少见淋巴细胞浸润；TG＋HI组甲状腺内多为胶质蓄积性大滤泡，上皮细胞扁平状，可见滤泡结构破坏及局部淋巴细胞浸润。小鼠FT3、FT4、FT4和TSHβ剪接变体表达组间比较差异有统计学意义（F=4．00、12．54、31．92、214．29，P均〈0．05）。与对照组比较，TG组TT3、TT4、FT4和TSHβ剪接变体表达升高（nmol／L：0．92±0．07比1．30±0．33、67．75±11．91比95．60±14．10；pmol／L：54．07±3．67比154．80±0．01；×10-3：4．1l±0．32比8．38±0．22；t值分别为-2．24、-3．02、-54．87、-19．11，P均〈0．05）；HI组TT4下降（nmol／L：67．75±11．91比45．50±3．85，t=3．55，P〈0．05）；TG＋HI组FT4和TSHB剪接变体表达升高（pmol／L：54．07±3．67比139．46±30．00；×10-3：4．11±0．32比5．33±1．47；t值分别为-5．65、-5．95，P均〈0．05）。结论Tg诱发了BALB／c小鼠自身免疫性甲状腺炎症反应，小鼠甲状腺中TSHβ剪接变体的表达明显升高，高碘可以加重Tg的这种反应，TSHβ剪接变体参与了自身免疫性甲状腺炎的病理过程。

AR-V7对前列腺癌激素抵抗敏感时间的预测作用

目的:分析雄激素受体剪接变异体7(AR-V7)对前列腺癌激素抵抗敏感时间的预测作用。方法:将本院100例经活检穿刺证实为前列腺癌的患者纳入研究,所有患者均接受内分泌治疗,利用免疫组化方法检测前列腺癌组织AR-V7的表达情况,利用Cox模型分析患者各临床因素对前列腺癌激素抵抗敏感时间的影响,采用Kaplan-Meier法分析AR-V7对前列腺癌激素抵抗敏感时间的作用,同时利用Log-rank法对结果进行显著性检验。结果:(1)100例患者内分泌治疗过程中前列腺特异性抗原(PSA)最低值平均(1.1±0.08)μg·L-1;到达PSA最低值的时间平均(8.2±0.03)个月;PSA半衰期平均(1.2±0.4)个月。至随访结束有88例进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),其激素敏感时间平均(28.5±1.8)个月。(2)AR-V7表达主要位于细胞核,仅有少数表达于细胞质中,100例前列腺癌患者中有25例患者AR-V7表达呈现阳性,75例患者表现为阴性。(3)Cox多因素分析显示PSA最低值、PSA半衰期及癌组织中AR-V7的表达量是影响激素敏感时间的因素,多因素分析结果显示PSA最低值(r=1.98,P=0.02)及AR-V7的表达量(r=2.93,P=0.003)是晚期前列腺癌患者激素敏感时间的独立预测因子。(4)AR-V7阳性患者的中位生存时间为(32±1.2)个月,ARV7阴性患者中位生存时间为(46±1.9)个月,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AR-V7是影响前列腺癌激素抵抗敏感时间的预测因子,其可能作为前列腺癌治疗新靶向。

生长激素释放激素受体剪接变异体1在子宫内膜异位症中的表达

目的:研究生长激素释放激素受体剪接变体1(SV1),一种生长激素释放激素(GHRH)受体的变体在子宫内膜异位症的表达模式。方法:在位和异位子宫内膜组织、腹膜B细胞采自有或没有子宫内膜异位症的妇女,正常卵巢组织采自没有子宫内膜异位症的妇女。分离异位子宫内膜基质干细胞(ESC)并加入GHRH培养,GHRH和SV1在样品组织的基因表达由RT-PCR检测,BrdU的摄入由特定的分析系统检测。结果:54份子宫内膜异位组织中有34份(63.0%)表达SV1 mRNA,显著高于在位内膜组织(4.3%)和正常卵巢组织(0.0%)。GHRH mRNA在异位子宫内膜组织的表达为22.2%(12/54),在位内膜组织中为25.9%,而在正常卵巢组织中为100.0%(14/14)和腹膜B细胞为81.3%(13/16)。GHRH能刺激表达SV1的ESC增加BrdU摄入。结论:GHRH和SV1在异位内膜表达谱不同于在位内膜,GHRH激活SV1并刺激细胞的增殖。

碘缺乏对BALB／c小鼠促甲状腺激素β剪接变体基因表达的影响

目的制备碘缺乏小鼠模型，检测促甲状腺激素（TSH）B剪接变体（TSHβ-v）是否受循环中甲状腺激素的调节，探讨免疫系统来源的TSHβ-V在维持甲状腺自稳态中的作用。方法选用离乳BALB／c小鼠20只，雌雄各半。小鼠按体质量和性别随机分为2组，每组10只。对照组：饮去离子水，普通饲料喂养；低碘组：饮去离子水，低碘饲料（含碘量20～40ug／kg）喂养，每日碘摄入量约为0．25ug／d。3个月后处死小鼠，化学发光免疫分析法（CIA）检测小鼠血清中甲状腺激素和TSH水平，实时定量（RT）-PCR法测定小鼠骨髓、外周血、甲状腺、垂体TSHβ-V的表达。结果低碘组小鼠血清总甲状腺素（TT4）、游离甲状腺素（FT4）、总三碘甲腺原氨酸（TT3）、游离三碘甲腺原氨酸（FT3）[（0．47±0．70）nmol／L、（2．41±0．28）pmol／L、（0．76±0．08）nmol／L、（4．01±0．40）pmol／L]显著低于对照组[（55．2±3．68）nmol／L、（32．72±1．02）pmol／L、（1．10±0．06）nmol／L、（5．40±0．38）pmol／L，t=43．81、86．04、9．81、7．51，P均〈0．01]；低碘组小鼠TSH[（35．67±17．39）mU／L]明显高于对照组[（0．24±0．10）mU／L，t=-6．11，P〈0．001]；低碘组小鼠骨髓、外周血TSHβ-VmRNA表达水平[（9．62±0．60）、（9．25±0．83）]均低于正常对照组（7．69±0．36、7．11±0．41，t=6．77、5．64，P均〈0．001）；低碘组小鼠甲状腺TSHβ-VmRNA表达（9．32±0．91）与对照组（9．12±0．62）相比较，差异无统计学意义（t=0．45，P〉0．05）；在骨髓、外周血、甲状腺未检出天然型TSHβ；垂体中TSHβ-VmRNA和天然型TSHβ表达水平（1.99±0．61、-7．17±1．78）均高于对照组（5．75±0．98、-1．43±0．51，t=-8．02、-7．60，P均〈0．01]。结论低碘饮食引发小鼠甲状腺功能低下，抑制骨髓和外周血TSHβ-VmRNA的表达，提示免疫系统来源的TSHβ-V可能具有比天然型TSHβ更重要的免疫一甲状腺调节作用。