TSH受体基因多态性(D36H)与自身免疫性甲状腺疾病的关系

目的 :探讨TSH受体 (TSHR)基因 3 6D→H变异在中国辽南地区汉族人群中的分布情况以及与自身免疫性甲状腺疾病 (AITD)的关系。方法 :应用PCR -RFLP法测定 72例Graves病 (GD) ,5 8例桥本甲状腺炎(HT) ,5 0例健康对照者的TSHR -D3 6H变异率和基因型。结果 :GD组出现 1例TSHR -D3 6H变异(1.4% ) ,HT组有 2例变异 (3 .4% ) ,AITD(CD +HT)组共 3例 (2 .3 % ) ,对照组为 1例 (2 .0 % ) ;变异率在各病例组之间以及各病例组与对照组之间比较 ,差异不显著 (P >0 .0 5 )。 4例变异皆呈原始细胞杂合型 (GC型 )。结论 :TSHR -D3 6H是一多态性改变 ,它与AITD的发生不相关 ;但不排除与其他AITD易感基因 (位点 )

pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。

TSHR蛋白表达质粒的构建和TSHR蛋白的表达

目的 :为获得足量的TSHR蛋白及建立Graves’病的动物模型。方法 :将构建于pCRTM3中的TSHRcDNA经限制性内切酶处理后 ,重新构建于表达型载体PinPointX质粒中 ,经酶切分析和PCR检测 ,并在E coliJM10 9中表达 ,Westernblotting免疫印迹法检测其免疫活性。结果 :证明TSHRcDNA基因正确地重组于PinPointX中 ,并在E coliJM10 9中表达 ,12 %SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定表达产物TSHR蛋白分子量为 10 7kD ,Westernblotting免疫印迹法证实其具有免疫活性。结论 :已成功地重组了TSHR的表达质粒 ,并得到了有相应免疫活性的TSHR蛋白。

转染中国仓鼠卵巢细胞人TSH受体的功能评价

目的研究转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞人促甲状腺激素(hTSH)受体(hTSHR)的功能。方法抽提已转染hTSHR的CHO细胞基因组DNA,PCR扩增目的条带,并对产物进行序列测定。采用受体的放射配体结合分析法,以固定量125I的牛促甲状腺激素(125I-bTSH)和浓度递增的未标记bTSH与hTSHR发生竞争结合反应分析受体的基本功能;通过TSH刺激试验测定细胞环磷酸腺苷(cAMP)含量,评价hTSHR的生物学活性。结果PCR扩增片段长度与预期相符,且序列完全正确。竞争结合反应表明,随着bTSH浓度的递增,125I-bTSH与hTSHR的结合量逐渐下降;TSH刺激试验显示,随着bTSH浓度的递增,细胞cAMP含量亦逐渐升高,当bTSH浓度为10 mIU/mL时,cAMP水平达到峰值。结论cDNA序列整合在CHO细胞基因组内并在细胞膜上表达的hTSHR,具有受体的基本功能特性和良好的生物学活性。该实验为自身免疫性甲状腺疾病患者血清甲状腺刺激性抗体(TSAb)和阻断性抗体(TSBAb)的检测奠定了基础。

TSHR大分子及其活性多肽在BALB/c小鼠体内的免疫原特性研究

目的:观察促甲状腺激素受体(TSHR)及其活性片段aa352-366在BALB/c小鼠体内的免疫原特性研究,探讨TSHR分子结构与功能的关系。方法:将血蓝蛋白(KLH)偶联的多肽TSHRaa352-366-KLH和多肽加受体混合组-TSHRaa352-366-KLH加豚鼠TSHR(gTSHR),间隔15d分两组分别注入BALB/c小鼠腹腔内,对照组注射KLH,测定各时相血清中甲状腺激素及促甲状腺激素受体抗体水平;90d后处死动物,检测小鼠甲状腺组织TSHRmRNA水平及其病理变化。结果:与各组自身0d的数据比较,多肽组小鼠血清TT3、TT4水平降低(P<0·01),TRAb升高(P<0·01);多肽加受体混合组TT3、TT4水平降低(P<0·01),TRAb(P<0·01)、TBAb(P<0·05)和TSAb(P<0·05)均升高。此外,混合组甲状腺组织TSHR mRNA水平明显高于正常组(P<0·05);多肽组小鼠甲状腺组织显示滤泡上皮细胞扁平、核缺失、皱缩及胶质浓缩等甲减的病理改变,而混合组则呈现不均一的病理变化。结论:TSHR以及活性片段hTSHRaa352-366都具有免疫原性,刺激小鼠血清TRAb、TSAb和TBAb的产生,引起甲状腺组织的病理改变。

hTSHR188-403bp基因免疫BALB/c小鼠建立Graves’病动物模型

目的:构建pcDNA3.1/hTSHR(188～403bp)重组质粒,并将其基因免疫BALB/c小鼠建立Graves’病动物模型。方法:RT-PCR扩增hTSHR膜外区188～403bp,与pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/hTSHR,用酶切、PCR及测序方法进行鉴定。于1、4、7、9、10周将重组体免疫实验组小鼠,对照组注射生理盐水,0、6、11周取血,检测血清TRAb、T4、TSAb、TBAb。取甲状腺常规病理切片,HE染色镜检。结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定证明插入方向正确,测序结果与GeneBank中hTSHR的相应片段序列相同。免疫组T4、TRAb和TSAb水平均从第6周开始显著升高(P<0.05),TBAb差异无统计学意义(P>0.05),对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组甲状腺病理检查结果,显示滤泡增生,胶质浓缩等Graves’病的病理表现,对照组形态正常。结论:构建了重组质粒pcDNA3.1/hTSHR(188～403bp),成功建立了类Graves’病动物模型。

用重组hTSHR胞外段测定女性AITD患者TRAb的研究

目的应用重组人促甲状腺素受体胞外段(hTSHRecd)蛋白在自身免疫性甲状腺病(AITD)患者中用以间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测TSH受体抗体(TRAb),建立一种简便快捷、敏感性及特异性均高的新的TRAb测定方法。方法病例组:女性,Graves甲亢(GD)患者59例,其中初诊23例;原发性甲状腺功能减退患者63例。对照组:非AITD甲状腺病(甲状腺囊肿或腺瘤,甲状腺功能正常)43例;正常对照50例。将重组hTSHRecd蛋白稀释成10μg/mL,包被酶标板,利用间接ELISA法测定上述各组样本血清TRAb,以放射受体分析(RRA)检测法为对照。结果间接ELISA法测定TRAb,各组OD450值分别为:正常对照组0.27±0.12,非AITD对照组0.32±0.26,GD甲亢组0.96±0.78,甲减组0.48±0.39。GD甲亢及甲减组与两个对照组相比均有显著性差异(GD甲亢t_1=6.79,t_2=6.30;甲减t1=4.27,t_2=3.26,均P<0.01)。用ELISA法和RRA法在AITD患者组中检测TRAb的阳性率分别为:GD甲亢组76.27%、81.36%,经比较无显著性差异(x^2=0.57,P>0.05);初诊GD甲亢组86.96%、91.30%,经比较无显著性差异(x^2=0.00,P>0.05);甲减组34.92%、39.68%,经比较无显著性差异(x^2=0.57,P>0.05)。用两种方法测得的TRAb活性值有相关性(r=0.577925,P<0.05)。结论 重组hTSHRecd蛋白与AITD患者血清有良好的反应性。间接ELISA法检测高效、简便、费用低,无同位素污染,在作为临床常规检验中优于RRA。

先天性甲状腺功能减退症TSH受体基因突变研究

目的:研究天津地区先天性甲状腺功能减退症(先天性甲减)患者的TSH受体(thyrotropinreceptor,TSHR)基因突变情况。方法:用TKM法提取18例先天性甲减、35例正常对照者外周血DNA,用PCR-SSCP技术分析TSHR基因第1、4、6、10外显子,突变经正反向测序证实。结果:发现1例先天性甲减患儿在TSHR基因第10外显子具有2个位点纯合子突变:450位密码子由CGC置换为CAC,Arg450→His(R450H);727位密码子由GAC置换为GAG,Asp727→Glu(D727E)。结论:D727E为TSHR基因多态性,失活性突变纯合子R450H导致该患儿先天性甲减。

TSH受体抗体测定的临床意义

目的:探讨血清TRAb的测定变化对G raves甲亢的临床意义。方法:应用放射免疫受体分析法(RRA)对302例甲状腺疾病患者及52例正常健康人的血清TRAb的值进行比较。结果:甲亢组TRAb的测定值阳性率为86.3%;甲亢缓解组TRAb的测定值阳性率为74.5%;甲亢治愈组TRAb的测定值阳性率为32.1%;甲亢复发组TRAb的测定值阳性率为90.3%;单纯性甲状腺肿组TRAb的测定值阳性率为0;甲瘤组TRAb的测定值阳性率为0;甲亢组、甲亢缓解组、甲亢治愈组、甲亢复发组与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01);单纯性甲状腺肿组、甲瘤组与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论:TRAb的测定对G raves甲亢的治疗具有重要的参考价值。

TSHR第三胞内袢基因突变与毒性多结节性甲状腺肿发病的相关研究

目的探讨促甲状腺激素受体(TSHR)第三胞内袢基因突变在毒性多结节性甲状腺肿(TMG)自主高功能性形成中的作用。方法将16例TMG患者手术切除标本及其作为对照的甲状腺正常组织,用酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA,对目的基因片断进行聚合酶链反应(PCR)及行DNA测序。结果在16例TMG 标本中,发现3例为622位密码子的点突变。异亮氨酸被苯丙氨酸置换(I622F,ATT→TTT),2例为单碱基插入性突变,在1928位和1929位核酸之间播入了一个鸟嘌呤核苷酸(G),使该密码子609位以后氨基酸发生了移码突变。在对照组中,未发现TSHR基因突变。结论 TSHR第三胞内袢基因突变,可能在TMG发病中起重要作用。

TSH受体单克隆抗体研究进展

TSH受体抗体（TSH receptor antibodies,TRAb）特异性存在于自身免疫性甲状腺疾病（AITD）患者体内,可与甲状腺细胞膜表面的TSH受体（TSHR）结合,产生一系列生物学效应.TRAb分为刺激性（TSAb）、阻断性（TBAb）及中性3种,在Graves病中,TSAb的作用占主导地位,而在慢性淋巴细胞性甲状腺炎（HT）中,TBAb可能起主要作用[1,2].以往的研究中,为获取TRAb,多采用粗提患者血清中TRAb的方法,该方法存在一定的局限性,如获得量少、纯度低、难以分离不同功能的抗体等.近年来随着单克隆抗体技术的发展,研究者已陆续成功制备多种TSH受体单克隆抗体,得到广泛应用.本文对TSH受体单克隆抗体的研究进展做一综述.

TSH受体抗体及临床意义

促甲状腺素受体抗体 (TRAb)不是均一性抗体 ,它至少包括四种抗体 ,这些抗体的测定在自身免疫性甲状腺疾病 GD及其甲状腺以外组织表现以及其他甲状腺疾患的诊断、评估疗效、确定停药时机。

高敏甲状腺功能试验——血β-TSH、FT_4、FT_3联合检验的临床意义

报告了458例血β-TSH、FT_4、FT_3放射免疫学检测结果,并对其临床意义进行了分析研究.β-TSH、FT_4、FT_3均可用于甲状腺疾病的诊断、鉴别诊断和治疗随访.甲亢时β-TSH减低,FT_4、FT_3增高,甲低时则相反,且均随病情好转而回复正常,病情控制不良可维持原状态,投药过量则引起药物性甲低或甲亢.单纯性甲肿时β-TSH、FT_4、FT_3基本无变化.妊娠后β-TSH、FT_4如常,FT_3降低.非甲病时β-TSH、FT_4、FT_3一般无变化,但存在低FT_3或/和FT_4血症,及高FT_4或/和FT_3血症.β-TSH、FT_4、FT_3联检能更好地反应腺垂体-甲状腺轴功能,并可相互佐证,提高准确性和及时发现其分离现象.试剂盒的国产化使其在我国广泛应用创造了条件。

hTSHR膜外区氨基端基因原核表达载体的构建和鉴定

目的:为研究人促甲状腺素受体膜外区氨基端(hTSHR462bp)肽段的免疫学特性,将hTSHR462bpcDNA片段在原核表达系统中表达,故构建原核表达载体。方法:以人Graves病患者甲状腺组织中提取mRNA为模板,利用RT-PCR方法扩增双链甲状腺组织cDNA,又以PCR技术扩增目的基因,定向克隆法构建融合基因的原核表达载体pET102-hTSHR462bp。结果:获得了重组目的基因原核表达载体并经PCR鉴定、酶切鉴定插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符。结论:成功构建了融合基因的原核表达载体pET102-hTSHR462bp,为进一步的蛋白表达、其生物学功能研究和未来临床应用奠定了基础。

Graves眼病患者血清FT_3、FT_4、STSH、TRAb检测的临床意义

目的探讨FT3,FT4,STSH,TRAb在Graves眼病(GO)患者发生中的价值。方法采用放射免疫分析法检测72例GO患者、88例Graves病(GD)患者及20例正常对照组血清游离T3(FT3),游离T4(FT4),促甲状腺激素(STSH),促甲状腺激素受体抗体(TRAb)值,并对GO组、GD组、正常对照组各指标的检测值及GO组和GD组患者TRAb的阳性检出率进行比较。结果GO组和GD组患者血清FT3,FT4,STSH值明显高于正常对照组(P<0.01);GO组和GD组患者间差异无统计学意义(P>0.05)。血清TRAb值在三组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。GO组明显高于另外两组(P<0.01)。患者血清TRAb阳性检出率GO组(86.11%)明显高于GD组(60.22%,P<0.01)。结论血清TRAb值在GO的诊断中具有重要价值;血清TRAb值的显著增高可考虑为诊断或/和预测GO发生的指标之一。

TSHR基因多态性与不同临床亚型的Graves'病治疗预后的关系

目的探讨山东潍坊地区汉族人群中染色体14q31区域的rs179247单核苷酸多态性(SNP)位点的等位基因及基因型频率分布情况及与不同临床亚型Graves'病(GD)治疗预后的关系。方法采用病例-对照研究方法,应用Taq Man探针技术在ABI Quant Studio^(TM)5荧光定量PCR仪上对1 961例不同临床亚型GD患者和553名健康对照者的SNP位点进行等位基因分型与检测,并进行统计学分析。结果染色体14q31区域的rs179247-A SNP与GD的遗传易感性相关(P_(Allelic)<0.001,OR=1.64,95%CI:1.42~1.89),遗传模型分析显示rs179247的显性模型相关性分析结果较显著(P_(Dominant)<0.001)。rs179247与不同临床亚型GD治疗预后未见明显相关(P_(Genotypic)=0.553)。结论 TSHR基因内含子1区域的SNP位点rs179247与山东潍坊汉族人群GD明显相关,rs179247-A是一独立致病位点,但其与不同临床亚型GD治疗预后不存在相关关系。

大鼠脂肪细胞TSH受体机能研究

目的：研究TSH及Graves'TgC对大鼠脂肪细胞的作用。方法：获取大鼠游离的脂肪细胞。溶脱TSH受体。采用A蛋白尾析柱纯化Graves患者的IgG以脂肪细胞内cAMP浓度及释放到孵化液中甘油浓度作为脂肪分解指标，用cAMP及甘油试剂盒测定cAMP浓度及甘油浓度。结果：1mU／ml的TSll能增加大鼠雅高脂肪细胞的cAMP浓度及甘油的释放。脓苷引起cAMP及甘油的TSH剂量依赖曲线向右移。Gare’TgG抑制[125I]-TSH结合于大鼠脂肪细胞膜上ISH受体，并能刺激雅高脂肪细胞内cAMP的形成。结论：ISH受体功能性表达于脂肪细胞，其生物学效应是通过活化腺耷环化酶而实现的。

自身免疫性甲状腺病TSH受体基因第一外显子突变的研究

目的 探讨自身免疫性甲状腺病发病与TSH受体基因第一外显子突变之间的关系。方法 用PCR SSCP方法对 1 46例Graves病 ,30例桥本甲状腺炎患者外周血白细胞DNATSH受体基因第一外显子突变进行筛查。结果 经PCR扩增后均出现明晰可辨的带型 ,SSCP分析1 76例无 1例出现异常泳动。结论 PCR SSCP分析未发现自身免疫性甲状腺病患者TSH受体基因第一外显子有突变 。

自身免疫性甲状腺病TSH受体抗体异质性研究

目的研究自身免疫性甲状腺病（ＡＩＴＤ患者ＴＳＨ受体抗体（ＴＲＡｂ的异质性。方法选择异质性ＴＲＡｂ患者６例，用ＥＢ病毒转染其外周血Ｂ淋巴细胞并筛选能产生单克隆ＴＲＡｂ的阳性细胞孔。结果６例患者的ＴＳＨ结合抑制免疫球蛋白（ＴＢＩＩ）测定值为５１％～８９％，患者１、２、４、５、６存在甲状腺兴奋性抗体（ＴＳＡ），而患者１、２、３可测得甲状腺阻断性抗体（ＴＳＢＡｂ）。以ＥＢ病毒转染外周血Ｂ淋巴细胞后，患者３有５个细胞孔能产生ＴＢＩＩ，患者６有４个细胞孔能产生ＴＳＡｂ。ＴＲＡｂ的测定值存在量效关系。结论ＡＩＴＤ患者可产生兴奋性或抑制性ＴＳＨ受体抗体，ＴＲＡｂ存在异质性。

Graves病患者治疗前、后血清甲状腺刺激抗体和TSH结合抑制免疫球蛋白活性的观察

本文研究了Ｇｒａｖｅｓ病（ＧＤ）患者在抗甲状腺药物（ＡＴＤ）治疗前、后血清甲状腺刺激抗体（ＴＳＡｂ）和ＴＳＨ结合抑制免疫球蛋白（ＴＢＩＩ）的变化，发现治疗前ＴＳＡｂ和ＴＢＩＩ的检出率分别为９１．７％和７９．２％，治疗后两抗体的活性及阳性率均显著下降，表明抗甲状腺药可改善ＧＤ患者的免疫异常。ＴＳＡｂ和ＴＢＩＩ活性不相关，提示ＴＳＨ受体抗体（ＴＲＡｂ）具有异质性。ＴＳＡｂ和ＴＢＩＩ活性与血清甲状腺激素水平无相关关系，说明体外测定的ＴＳＡｂ或／和ＴＢＩＩ活性并不能完全反映甲亢的严重程度。