筛选用转座子Tn916诱变的具有免疫原性的嗜水气单胞菌蛋白酶缺失株

以携带质粒pAM120(Apr、Tcr/Tn916)的大肠杆菌CG120株为供体菌，与受体菌嗜水气单胞菌J-1株，采用滤膜接合法进行接合转移，在选择平板(含Tc、cfz和脱脂奶)上进行筛选，筛选出6株蛋白酶缺失株(ECPase-)，ECPase-菌株其生长速度，对正常鲫血清的抗性降低，用脱脂奶平板法及底物法检测，蛋白酶产量明显降低。与亲本J-1株相比，突变株致病力降低，对鲫的半数致死量大于108(J-1株对鲫的半数致死量为5×103)。用ECPase-突变株MJ-1株的18h培养物(5×106CFU)接种健康鲫，不产生亲本J-1株引起的病变及死亡。用MJ-I活菌免疫鲫，在第5周产生较高的凝集抗体，且对强毒株J-1的攻击有保护作用。表明蛋白酶是嗜水气单胞菌的一个重要的毒力因子，ECPase-突变株仍具有免疫原性。

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分泌菌株的筛选

以携带质粒pAM120(Ap^r,Tc^r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli CG120)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)采用滤膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子(10^(-5)/每个供体菌,选择四环素抗性)。从846株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株3株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达7.5～14.0mmol/L。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源上的固氮活力,发现20mmol/L NH Cl的存在不抑制其固氮活性,固氮活力与无氮条件下野生株的活力相差不多。无选择压力下细胞分裂50代后的稳定性实验证明,转座子Tn916在氨分泌突变株中的稳定性在50％～80％之间。以固氮螺菌氨分泌突变株为供体菌株,对E.coli HBX1进行反向接合转移实验,证实Tn916确实存在于氨分泌固氮螺菌接合子中。

接合转座子Tn916的水平基因转移

水平基因转移(HGT)极大地提高了细菌物种对环境的适应性,促进了细菌的进化.原核生物通过水平基因转移获得的基因片段为基因岛(GEIs).接合转座子(CTns)则是一种常见的可移动基因岛,通过接合进行水平基因转移,并主要传播抗生素抗性.该文介绍与讨论了一种发现较早,且被广泛研究的接合转座子Tn916的重组、接合转移和调控模块,阐述了这类接合转座子的一般结构、转移机制和影响.

猪肉中单核细胞增生李斯特菌的分离与耐药性研究

了解猪肉中单核细胞增生李斯特菌的污染情况、血清型和耐药性现状。按照国标GB 4789.30-2010程序分离猪肉中单核细胞增生李斯特菌;多重PCR确定血清型;纸片扩散法检测单核细胞增生李斯特菌对抗生素的敏感性。研究结果表明273份猪肉样本中有52(19.02%)个受单核细胞增生李斯特菌的污染,共检出78株该致病菌。33株(42.31%)、24株(30.71%)、16株(20.51%)、3株(3.85%)、2株(2.56%)分别被确定为血清型1/2a(或3a)、1/2b(或3b或7)、1/2c(或3c)、4a(或4c)和4b(或4d或4e)。所有菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培能、环丙沙星、左氧氟沙星、万古霉素都敏感,对四环素(20.51%)的耐药率最为严重。11.54%的菌株对临床治疗李斯特菌病的青霉素、庆大霉素、红霉素等抗生素出现耐药。tet(M)基因是单核细胞增生李斯特菌耐四环素的主要机制之一,接合型转座子Tn916与该菌四环素耐药散播有直接关系。

食源性单核细胞增生李斯特菌四环素、红霉素耐药基因研究

研究了食源性单核细胞增生李斯特菌四环素、红霉素耐药基因的分布状况及和耐药表型的关系。采用微量肉汤稀释法对2005~2007年河北省疾病预防控制中心分离到的食源性单核细胞增生李斯特菌株进行四环素、红霉素药敏实验;应用PCR方法对实验菌株进行四环素耐药基因tet（M）、tet（S）、tet（L）、tet（K）、tet（B）、及与tet（M）基因关系密切的转座子Tn916、红霉素核糖体甲基化酶基因ermB、ermC、及与ermB基因关系密切的转座子Tn917检测,对阳性样本序列进行鉴定分析;应用血清学分型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、及脂肪酸聚类分析方法分析四环素耐药菌株之间的相关性,确定基因型和多态性。结果表明,91株单核细胞增生李斯特菌四环素敏感77株、耐药14株;红霉素敏感89株、耐药2株,其中包含1株菌同时交叉耐药四环素和红霉素;14株四环素耐药株中含tet（M）基因的13株,在13株tet（M）基因阳性菌中,tet（M）位于Tn916转座子上的9株;1株同时交叉耐药四环素、红霉素菌同时携带tet（S）、ermB基因;ermC基因、转座子Tn917均为阴性;四环素、红霉素敏感株中未检测到上述任何耐药基因。14株四环素耐药菌株血清型分布以1/2a型为主（n=12）,部分菌株PFGE、脂肪酸分型完全一致。食源性单核细胞增生李斯特菌获得tet（M）基因是耐四环素的主要机制之一,具有水平传播耐药基因能力的接合型转座子Tn916与该菌四环素耐药播散有直接关系;ermB基因介导的核糖体靶位点改变存在食源性单核细胞增生李斯特菌红霉素耐药株中;PFGE基因型结合脂肪酸聚类分析能够用来分析菌株之间的相关性。

嗜水气单胞菌若干毒力因子同时缺失的突变株的构建及特性分析

以携带质粒pAM12 0 (Tcr Tn916 )的大肠杆菌CG12 0株为供体菌 ,采用滤膜接合法与受体菌嗜水气单胞菌J_1株 (cfzr)进行接合转移 ,在含Tc和cfz选择平板上进行筛选。共获接合转移菌落 380 0个 ,其接合频率为 3× 10 - 5(按供体细胞计算 )。任取 38个接合子 ,提取基因组DNA ,以嗜水气单胞菌特异性 16SrDNA引物进行PCR扩增 ,所有接合子均阳性。为证明Tn916确实插入基因组 ,以四环素基因 (tet)引物进行PCR扩增 ,结果所有抗性接合子均扩增出一条特异条带。与亲本J_1株相比 ,所有接合子的主要毒力因子如蛋白酶、溶血素、DNA酶和淀粉酶等均不表达 ,对小鼠失去致病力 ,其LD50 大于 10 9CFU。接合子连传 10次后 ,四环素抗性消失 ,但毒力未恢复 ,说明通过转座子Tn916的插入可获得稳定的无毒嗜水气单胞菌突变株。Tn916引起嗜水气单胞菌毒力性状改变的机制有待研究 ,推测可能与该菌染色体上存在Tn916的热点或毒力岛有关。

脱卤脱亚硫酸菌脱氯呼吸链的遗传分析

以携有结合转座子Ｔｎ９１６的Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＨ２－２为供体，脱卤脱亚硫酸菌ＨＳＳ１（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ，Ｓｍ抗性突变株）为受体，在厌氧条件下，通过滤膜杂交、结合转移，将Ｔｈ９１６转移并插入到受体菌的染色体上，其转移频率为：１．１×１０－７～３×１０－８。 在丙酮酸／乳酸－３－氯－４－羟基苯氧乙酸、Ｔｃ、Ｓｍ培养基上，筛选脱氯呼吸的缺陷型突变株，并用反向ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲ）技术，获得插入相应位点的染色体ＤＮＡ片段，进一步分析脱氯呼吸链的遗传背景。

儿童A族链球菌emm分型变迁与大环内酯类耐药的关系

目的通过对1993-1994年和2005-2008年456株儿童A族β溶血性链球菌（GAS）分离株抗生素敏感性、耐药基因及转座子Tn916的emm分型检测,探讨GAS对抗菌药物敏感性的变化与转座子Tn916的关系。方法采用琼脂稀释法检测临床分离株对8种抗生素敏感性;PCR检测大环内酯类耐药基因ermB、ermTR、mefA,四环素耐药基因tetM和Tn916家族转座子基因int、xis;PCR扩增及测序对菌株进行emm分型;对每种emm型的代表菌株进行PFGE分型。结果与1993-1994年比较,2005-2008年GAS菌株,红霉素、克林霉素、泰利霉素的耐药率增加（79.7%vs 94.0%,75.4%vs 96.9%,20.37%vs 87.93%）;大环内酯类抗生素耐药菌株int、xis、tetM和ermB基因的携带率增加（P〈0.05）;emm1型和emm12型菌株ermB基因携带率增加（65.20%vs 86.23%,7.7%vs 91.8%）。结论我国儿童GAS大环内酯耐药性在16年间增加,可能与emm型变化及大环内酯类抗生素耐药机制的变化有关,分离菌株的Tn916族变化可能与耐药性增加相关。

2011年北京市朝阳区儿童A组溶血性链球菌的emm基因分型及耐药性分析

目的了解2011年北京市朝阳区儿童感染A组溶血性链球菌(GAS)的emm基因分型及对红霉素和克林霉素的耐药情况及耐药基因谱的特点。方法从猩红热或咽峡炎及扁桃体炎儿童患者的咽拭子培养分离获得71株GAS,应用PCR扩增emm基因及红霉素耐药基因mefA、ermA、ermB和转座子基因Tn916;采用E-test法进行药敏试验并分析耐药情况。结果北京市朝阳区儿童感染GAS的emm12.0基因型占87.4%,其次为emm1.0型(9.8%)、emm22.0型(1.4%)、emm75.0型(1.4%);GAS对红霉素和克林霉素的耐药率为100%和95.8%,两种药物的交叉耐药率为95.8%;耐药基因ermA、ermB、mefA和转座子基因Tn916的携带率分别为5.6%、90.1%、4.2%和90.1%。结论北京市朝阳区2011年儿童感染GAS的主要流行株为emm12.0型,对红霉素普遍具有较高的耐药率且与克林霉素之间存在显著的交叉耐药;ermB基因是决定本地区2011年儿童感染GAS对红霉素耐药的重要基因;而Tn916转座子基因在GAS菌株间耐药基因扩散中起重要作用。

中国部分食品分离单增李斯特菌的抗菌药物敏感性及耐药基因检测

目的了解我国部分食品中分离单增李斯特菌的抗菌药物敏感性和耐药性,探讨单增李斯特菌耐药基因的携带与耐药表型的关系。方法采用微量肉汤稀释法对2005-2011年从我国7个省市/地区食品分离的203株单增李斯特菌进行庆大霉素、氨苄西林、头孢噻吩、青霉素、四环素、强力霉素、亚胺培南、红霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、利福平、万古霉素、氯霉素、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、诺氟沙星、头孢呋肟、多粘菌素B、呋喃妥因、氯林可霉素共20种抗菌药物药敏试验,采用PCR方法对实验菌株进行9种耐药基因及接合型转座子Tn916检测,并对阳性基因产物进行序列测定分析。结果食源性单增李斯特菌对多粘菌素B、呋喃妥因、头孢呋肟、氯林可霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素的耐药率分别为98.52%、55.66%、50.25%、12.81%、2.46%、1.97%、0.99%、0.99%和0.49%。203株单增李斯特菌中,5株对四环素耐药的菌株均检测出tetM基因,其中3株菌的tetM基因位于接合型转座子Tn916上。结论食品中分离的单增李斯特菌存在不同程度的耐药情况,并有83株多重耐药株存在,具有引起食源性单增李斯特菌感染的风险存在,应加强对抗生素使用的管理以保证食品安全及公众健康。

北京市丰台区2011-2014年A组乙型溶血性链球菌emm基因分型及耐药基因分析

目的了解北京市丰台区2011-2014年A组乙型溶血性链球菌(GAS)的基因分型及对红霉素耐药基因谱的特点。方法用猩红热、扁桃体炎或咽峡炎患者的咽拭子进行细菌分离培养,应用PCR方法检测emm基因及耐药基因erm A、erm B、mef A、转座子基因Tn 916。结果北京市丰台区2011-2014年感染GAS的emm 12.0基因型占78.33%,其次为emm 1.0基因型(20.00%)、emm 22.3基因型最少(1.67%);耐药基因erm B及转座子基因Tn916的携带率均为100.00%,所有菌株都不携带耐药基因erm A和mef A。结论北京市丰台区2011-2014年感染GAS的流行株为emm 12.0型;本地区菌株对红霉素耐药率较高,菌株间耐药基因扩散现象明显。