一种斑马鱼肝脏特异表达转基因载体的制备方法

目的:建立一套快速制备斑马鱼肝脏特异表达转基因载体的新方法。方法:首先利用multi-site gateway技术将斑马鱼肝脏脂肪酸结合蛋白(fabp10a)启动子片段与入门载体进行BP重组获得启动子的入门克隆pENTR-fabp10a,然后将目的基因克隆到载体pME-MCS中形成入门克隆pENTR-interest,最后通过multi-site gateway技术将pENTR-fabp10a、pENTR-interest和含有EGFP标记基因的p3E-IRES-EGFPpA质粒在Tol2转座载体pDestTol2pA2上进行定向重组即可获得斑马鱼肝脏特异性表达转基因载体pTol2-fabp10a-interest-IRES-EGFP。本研究采用红色荧光蛋白基因DsRed2作为目的基因,用上述方法构建了转基因载体pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP,并将其注射至单细胞期斑马鱼胚胎中进行表达分析。结果:转基因载体pTol2-fabp10a-DsRed2-IRES-EGFP在斑马鱼肝脏组织中能实现红色和绿色荧光蛋白同步特异表达。结论:利用Tol2转座系统以及multi-site gateway技术构建斑马鱼肝脏特异性表达转基因载体是一套行之有效的方法。

心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估

本课题组前期研究中,利用斑马鱼cmlc2(Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系,并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明,在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中,绿色荧光信号在心脏中特异表达,该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同;该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常;进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明:该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型,研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。