2012年-2022年TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在云南主要烟区的发生与分布

烟草丛顶病(tobacco bushy top disease,TBTD)是一种由烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)及其卫星RNA(tobacco bushy top virus satellite RNA,TBTVsatRNA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV)及其伴随RNA(tobacco vein distorting virus associated RNA,TVDVaRNA)共同侵染引起的危险性病害,曾在云南很多烟区造成严重损失。本研究对烟草丛顶病及其相关病原物在云南烟草上的发生情况进行了多年的调查研究,力图对烟草丛顶病及其相关病原物的发生与分布进行追踪和分析。结果表明,2012年-2022年,烟草丛顶病在云南各大烟区仅零星发生,2019年以来已很难发现。烟草丛顶病的相关病原物主要在曾经暴发流行过病害的楚雄、保山和大理发现,且TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在烟草上并不总是同时被检出,其中引起烟草丛顶病典型症状的TBTV+TVDV+TBTVsatRNA+TVDVaRNA检出率在5%以下,TVDV的检出率最高,达30.44%,TBTVsatRNA的检出率最低,为7.68%。TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA不能同时感染同一烟株可能是当前烟草丛顶病很少发生的主要原因。

烟草扭脉病毒云南分离物rtp基因克隆及序列分析

探究来自云南不同时间和不同地区的烟草扭脉病毒(TVDV)各分离物间rtp基因序列差异,分析烟草丛顶病近年在田间发生趋势减缓的原因.以2020—2022年从云南楚雄、大理、保山及红河采集的染病烟草样品为材料,对TVDV的rtp基因进行扩增和序列分析,共得到TVDV 7个不同分离物的rtp基因序列,长度均为2172 nt,包含618 nt的cp基因及1554 nt的rtd区;推导的TVDVRTP蛋白共编码722个氨基酸,其中包含CP蛋白的205个氨基酸,RTD的517个氨基酸.多重序列比对结果发现,获得的7个TVDV分离物与GenBank上登录的其他TVDV分离物间cp基因核苷酸序列一致性为98.71%~100%,不同TVDV分离物间CP蛋白的氨基酸序列一致性为98.05%~100%,存在4个氨基酸的差异.获得的7个TVDV分离物与GenBank数据库登录的其他TVDV分离物间rtd区核苷酸序列一致性为96.68%~99.81%,RTD蛋白的氨基酸序列一致性为96.52%~100%,存在39个氨基酸的差异.这些TVDV分离物rtp基因的变异可能会对TVDV的蚜虫传播效率产生影响,进而影响到烟草丛顶病在田间的发生与流行.

利用免疫荧光标记技术分析TVDV在介体蚜虫消化道内的分布

【目的】制备TVDV CP蛋白抗血清,明确TVDV侵入蚜虫消化道的部位以及TVDV在蚜虫体内的分布。【方法】首先构建原核表达载体p DEST17-TVDV-CP,所得载体转化到Rocceta菌株中诱导表达TVDV CP蛋白,收集目的蛋白免疫小鼠制备TVDV CP特异性抗血清。再利用制备的抗血清,通过免疫荧光技术标记TVDV,对TVDV在介体蚜虫中的分布解剖观察。【结果】TVDV CP蛋白在Rocceta菌株中,IPTG溶度为1、0.5、0.2、0.1 mmol/L,温度为28℃都能成功诱导表达;所得抗血清对TVDV侵染蚜虫总蛋白进行western blot检测,检测到大小约24 ku特异性条带;对免疫荧光标记的蚜虫消化道进行共聚焦观察,在蚜虫中肠上皮细胞检测到标记的TVDV荧光信号。【结论】制备了TVDV CP特异性抗血清,明确了TVDV分布于介体蚜虫消化道的中肠,由介体蚜虫以循回方式传播。

烟草丛顶病研究进展

烟草丛顶病是一类在局部地区产生严重危害的烟草病害,由烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒复合侵染引起。目前该病在我国仅云南有发生的报道,烟草丛顶病也是国内第一个报道的由幽影病毒属成员引起的病害。本文较为系统全面地综述了烟草丛顶病的发生与分布、病害症状学、病原物、与病害相关的dsRNA、病组织超微病变以及病害的流行及控制等方面的研究进展。

烟草脉扭病毒基因组部分序列的克隆和分析

烟草脉扭病毒(Tobacco vein distorting virus, TVDV)是引起烟草丛顶病的两种病毒之一。TVDV被归为黄症病毒科的暂定成员。应用黄症病毒科的通用引物和根据马铃薯卷叶病毒属成员核酸序列设计的简并引物,通过RT—PCR从烟草丛顶病烟株总RNA中扩增到了TVDV基因组的部分序列。序列分析获得了长度为1654 bp的序列,编码推测的TVDV复制酶基因的部分序列、外壳蛋白基因及运动蛋白基因的全部序列。根据这三个基因编码的氨基酸序列构建的分子进化树分析表明,TVDV为黄症病毒科的确定成员。根据其基因间隔区的长度特征和各ORF编码的氨基酸的分子进化分析,我们推测TVDV应当是马铃薯卷叶病毒属的一个新成员。这是TVDV的分子生物学特征的首次报道。

从烟草丛顶病病原复合物中分离烟草扭脉病毒的方法

烟草丛顶病是由烟草丛顶病毒（TBTV）、烟草丛顶病毒类似卫星RNA（Sat-TBTV）、烟草扭脉病毒（TVDV）和烟草扭脉病毒相关RNA（TVDVaRNA）复合侵染引起的一类特殊病害,目前尚不清楚这些病原物各自在病害症状形成和病害传播中的作用。本文根据蚜虫传播烟草丛顶病复合病原物传毒特性的差异,探索了3种分离TVDV的生物学方法。方法A为将获得了烟草丛顶病复合病原物的蚜虫饥饿24h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法B为将无毒蚜虫饥饿2-4h后转接到感病烟株上饲毒48h,再以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法C为将无毒蚜虫于感病烟株上饲毒48h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒24h,此后每隔24h将蚜虫移到另一健康烟株上传毒,直到蚜虫死亡。其中方法 A和B均可将TVDV从烟草丛顶病病原复合体中分开,方法A操作简单、分离周期短且TVDV的分离效率高。单独TVDV侵染的烟株无明显的丛顶症状,叶片靠近主脉的地方会出现皱缩,生长后期叶片变得细长且顶端会发生扭曲。本试验可为研究TVDV与其他病原物、寄主植物和传播介体的相互作用提供很好的试验材料,也可为蚜虫传播的复合侵染病毒的生物学分离提供参考。

烟草丛顶病野生毒株的致病力分化

为了确定不同地理区域和不同烟草寄主来源烟草丛顶病病原的致病力分化,采集了12个烟草丛顶病野生毒株样品,经纯化后在温室分别用蚜虫传毒和摩擦接种方法测定了它们的致病性。2种方法接种后第28天调查结果发现来自西双版纳州勐海县的TBTV-7野生病毒株发病率分别为17%和16%,其余11个野生病毒株的发病率均在70%以上,表明不同地区烟草丛顶病野生毒株存在致病力分化的现象。

2种类型的烟草扭脉病毒外壳蛋白基因的序列和结构分析

烟草丛顶病主要由烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）和烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）复合侵染引起。其中,TVDV的CP蛋白可分别包装TBTV和TVDV形成病毒粒子;但也存在TVDV单独侵染不携带TBTV的病样。本文利用RT-PCR对自然状态下携带TBTV的TVDV（采自云南弥渡）和不携带TBTV的TVDV（采自云南保山）的cp基因进行序列克隆,发现TVDV弥渡分离物的cp基因为618个核苷酸,而TVDV保山分离物的cp基因为621个核苷酸,二者的核苷酸序列一致性为90.02%,氨基酸序列一致性为89.81%;而长度相同的TVDV cp基因序列一致性为98.5%~100%。表明这2个cp基因属于2种不同类型。系统发育树分析也表明这2个cp基因属于进化距离较远的2个群。利用SWISS-MODEL进行同源建模,发现2种类型的TVDV CP蛋白的主要空间结构域基本一致,存在细小的结构域及结构域之间无规则卷曲角度的差异,整体空间结构没有发生明显改变。推断TVDV保山分离物CP蛋白中关键氨基酸的序列突变是导致CP无法包装TBTV,从而在病害传播过程中丢失TBTV的主要因素。

云南三七病毒病的发生及病毒种类检测

对云南省文山市、昆明市、红河州、曲靖市的三七主要种植区进行病毒病调查及相关病毒检测,发现病毒病在上述地区均有发生,年平均发病率均在5%以上,且种植年限越长发病率越高,已成为三七上仅次于根腐病的主要病害。三七病毒病症状类型复杂多样,主要有白化、黄化、褪绿、斑驳、皱缩、卷叶和坏死等。利用PCR/RT-PCR对2011年~2015年,以及2017年采集的466份疑似病毒病样品进行检测,发现侵染三七的病毒主要有三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)、中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)及其卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)、三七A病毒(Panax notoginseng virus A,PnVA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV),基中PnVY为当前为害云南三七的优势病毒,TVDV在三七上侵染为害系黄症病毒科成员侵染人参属植物的首次报道。PnVY、TYLCCNV、PnVA和TVDV的平均检出率分别为51.5%、31.9%、10.7%和7.0%,存在PnVY+TYLCCNV、PnVY+PnVA以及PnVA+TVDV复合侵染的现象,复合侵染的检出率分别为20.6%、3.4%和0.3%。未检测到番茄斑萎病毒(tomato spotted w ilt tospovirus,TSWV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CM V)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒、毛形病毒属(Crinivirus)病毒,以及菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中除TYLCCNV以外的其他病毒。