Generation of two transgenic amphioxus lines using the Tol2 transposon system

Amphioxus or lancelets are regarded as a promising model animals for studying developmental mechanisms in chordates, and the evolution of vertebrate characters, because of their important phylogenetic position and their genomic and anatomical simplicity （Bertrand and Escriva, 2011; Holland and Yu, 2004）.

一种利用Tol2转座子快速获得牙鲆稳转细胞的方法

脂质体转染是分子生物学中研究基因功能和基因表达调控的常规手段。然而,在海水硬骨鱼细胞中,脂质体转染效率低下且很难通过转染后直接筛选的方式获得稳转细胞。本研究以pminiTol2为模板,在末端反向重复序列中间添加了CMV启动子、EGFP荧光蛋白、新霉素抗性基因等功能区域,构建了CMV-EGFP-pminiTol2重组载体。CMV-EGFP-pminiTol2和pCS-TP质粒经脂质体包裹共转染至牙鲆(Paralichthys olivaceus)卵巢颗粒细胞后,仅需2~3周的新霉素(G418)筛选即可获得稳定转染的细胞。本实验首次探究了利用Tol2转座子系统快速筛选获得牙鲆稳转细胞的方法,其研究成果可应用于牙鲆分子生物学研究,并为其他硬骨鱼类稳转细胞构建及筛选提供新思路。

转座子Tol2的特性及其在转基因动物中的应用

Tol2转座子是hAT转座子家族中的一员,是目前发现的唯一一个可以编码具有完整转座酶功能的自主性转座子。已证实Tol2转座子在斑马鱼、鼠、人等多种动物细胞中都具有转座活性,有可能作为脊椎动物特有的转座子系统,在转基因方面具有重要的应用前景。综述了Tol2转座子的结构、转座机制和在脊椎动物转基因生产中的最新研究进展,以期为今后这方面的研究提供参考。

利用Tol2转座子构建转基因草金鱼初探

青鳉Tol2转座子是脊椎动物中发现的第一例天然具有活性的转座子,目前已经被成功应用于多种模式动物的转基因研究中。采用PCR的方法以质粒pCAgcGH为模板亚克隆出一段含有草鱼生长激素(GH)5个外显子、鲤鱼β-actin启动子及多个酶切位点的序列,并将这段序列与经双酶切处理的质粒pTol2-MCS-EGFP进行重组连接,得到重组质粒pTol2-GH-EGFP。采用显微注射的方法将重组质粒pTol2-GH-EGFP与体外合成的Tol2转座酶mRNA一起注入草金鱼受精卵中。通过观察绿色荧光和PCR检验绿色荧光蛋白和GH基因的表达,筛选出成功转入外源基因的草金鱼。阳性表达检出率为17.3%。利用Tol2转座子构建转基因草金鱼,不仅丰富了Tol2转座子的应用范围,而且为进一步利用Tol2转座元件进行观赏鱼转基因及基因表达研究奠定了基础。

Tol2转座子系统在转基因动物中的应用

Tol2是在青鳉鱼基因组中发现的一种具有自主性的转座子元件。它编码转座酶,催化Tol2转座子结构中5'端200 bp和3'端150 bp序列发生转座反应。Tol2的多种特性,如可携带大片段外源DNA、单拷贝整合效率高、转座子活性强等,使得以Tol2转座子系统为载体的转基因技术在多种生物中得到应用。综述了Tol2转座子系统的结构、特性以及近年来在多种动物转基因中的应用。

热激活的Vg1转基因文昌鱼品系构建及表型分析

[目的] Vg1作为Nodal信号通路的重要配体之一参与了早期胚胎发育过程中的背腹分化调控及左右不对称模式的建立.构建Vg1转基因文昌鱼品系以研究其在文昌鱼胚胎不同发育阶段的功能.[方法]结合Tol2转座子转基因系统和热敏启动子Hsp70构建文昌鱼BbHsp70-BfVg1稳定转基因品系;并用热激实验、表型统计和原位杂交等手段对该转基因品系的有效性进行评估.[结果]热激结果显示,在囊胚晚期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎背腹轴形成异常;在原肠胚中期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎原本左右不对称的器官变为对称分布.基因表达分析结果显示,在囊胚晚期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的Vg1呈现全身性表达,背部中胚层标记基因Gsc表达扩张,腹部标记基因Evx表达下调,神经标记基因SoxB1a向腹侧蔓延;在原肠胚中期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的左侧特异基因Pitx呈现两侧对称表达,左侧口前窝标记基因Pit呈现两侧对称表达.[结论]初步构建了一个能够实现实时热激活Vg1的文昌鱼稳定转基因品系,并为后续在文昌鱼中进行基因功能研究提供了一个新手段.

多转座子载体的构建及转座特性比较研究

【目的】转座子(transposon,Tn)是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty(SB)、piggy Bac(PB)和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol23种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至p T2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至p T3-PST载体,获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、p CMV-HAhy PBase、p CMV-Tol2以1﹕1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞(3T3),同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后,用荧光显微镜进行检测GFP表达率,提取细胞基因组,以Amp基因作为内参,进行实时荧光定量PCR,检测GFP插入拷贝数;根据被剪切位置上下游序列设计引物,进行实时荧光定量PCR,检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后,用浓度为500μg·m L-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞基本全部死亡(10 d),将细胞进行吉姆萨染液染色,统计耐药细胞数,从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%,且差异不显著(P>0.05)。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组,但差异不显著(P>0.05),均显著高于对照组(P<0.05)。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组(P<0.05),但SB和PB组之间差异不显著(P>0.05)。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞,G418抗性筛选结果表明,SB组耐药细胞数显著高于PB和Tol2组(P<0.05),但PB和Tol2两组差异不显著(P>0.05),此3组均极显著高于阴性对照组(P<0.01)。【结论】SB转座子系统在细胞水平的转座效率优于PB和Tol2,为细胞水平的转基因研究提供有效基因转移工具。

斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的在我们的前期研究工作中,通过Tol2转座子介导的插入突变,筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2:20141221t的GFP在神经系统中表达,但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置,造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法使用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)鉴定Tol2转座子插入的基因组位置;利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性;筛选鉴定纯合体突变体,并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果在该品系中,Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a,sat1.a)的第八个内含子区域,致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体,但是没有检测到明显的发育缺陷。结论筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷,但可以作为研究神经系统发育的有力工具。

利用Tol2转座子构建斑马鱼心脏组织特异表达转基因载体及其表达分析

为了制备用于在斑马鱼心脏中特异表达目的基因的转基因载体,通过分子克隆的方法对能够在斑马鱼心脏中特异表达EGFP报告基因的Tol2载体进行了改造,在原有的CMLC2启动子与EGFP编码区之间插入带有多克隆位点的IRES序列,获得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体,该载体可以实现在同一个启动子CMLC2的驱动下分别同时表达目的基因和EGFP;为了验证该表达载体的有效性,进一步在CMLC2启动子与IRES序列之间插入DsRed-Monome编码区,利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析,结果表明外源目的基因DsRed-Monome和报告基因EGFP均能以相同的表达模式在斑马鱼心脏组织中特异表达。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立心脏发育候选基因的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义。

Tol2转座子介导斑马鱼rps26基因附近增强子捕获及注解分析

随着人类等生物大规模基因组测序工作的完成,认识和理解基因组上表达调控元件成为后基因组时代的重要研究任务,增强子捕获技术是一种鉴定基因组上增强子元件及其对基因表达调控机制的有效方法。本研究选择Tol2转座子系统介导制备的稳定增强子捕获品系TK4系(头部和躯干特异性GFP表达),利用Splinkerette PCR(sp-PCR)、原位杂交和比较基因组学等技术手段进行所捕获增强子的解析研究。将TK4系的F1代与野生型斑马鱼杂交,收集受精卵,于6 hpf(Hour post fertilization)、24 hpf、48 hpf、3 dpf(Day post fertilization)、4 dpf、5 dpf六个发育阶段通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白报告基因的表达模式;然后通过sp-PCR方法克隆到Tol2转座子插入位点斑马鱼基因组侧翼序列,经比对分析表明插入位点位于基因组23号染色体27749253位置,在rps26基因的intron1中,且报告基因插入方向与基因方向相反。在插入位点100 kb的基因组范围内有7个基因,分别为arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。通过VISTA程序对不同脊椎动物基因组同源序列比对结果显示,在rps26基因下游有2个潜在保守的非编码序列区CNS1(Conserved non-coding sequence)和CNS2,为可能的增强子元件。胚胎原位杂交表明:rps26基因的两个转录本有母源性表达,rps26-201在合子中的表达早于rps26-001,而TK4系斑马鱼的GFP在早期(6 hpf)不表达,后期rps26与GFP的表达模式既存在相似性,也存在差异性,提示两者可能既接受共同的增强子调控,但也存在不同增强子调控,所获得的2个潜在的增强子(CNS1和CNS2)可能对附近的基因(包括rps26)发挥差异的时空表达调控作用。本研究首次成功获得rps26基因附近2个潜在增强子,为深入研究这两个增强子对基因组附近基因的表达调控机制奠定基础,本研究所采用的结合技术手段也为增强子解析提供参考。

绒山羊细菌人工染色体重组及细胞转染系统

绒山羊(Cashmere goat)是一类以生产山羊绒为主的山羊品种,因其绒毛纤细有光泽、轻盈、保暖而备受青睐。绒山羊角蛋白关联蛋白(Keratin associated protein,KAP)和骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)在羊绒纤维毛囊细胞的增殖和分化过程中起重要作用。为了提高山羊绒的产量和品质,对包含kap6.3,kap8.1和bmp4基因的细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)进行研究。首先采用同源重组的方法对BAC进行修饰,其次将哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子加入BAC中,最后采用Amaxa Nucleofector核转染技术将修饰过的BAC转入绒山羊成纤维细胞。结果表明成功构建了含有目的基因的BAC-Tol2载体。载体上包含UBC启动元件的egfp标记基因和真核筛选抗性neo基因,并且载体的两端加有loxp元件,为转染细胞后标记和抗性基因的去除作准备。载体转染细胞效率达到1%-6%,最高可达10%。成功获得了外源整合kap6.3、kap8.1和bmp4基因的细胞株,为以后克隆绒山羊作准备。研究表明,在BAC的修饰中应用Tol2转座子系统增加了电转染后的整合率,提高了BAC无错重组的效率和精确性。

荧光转基因斑马鱼Tg(ttn.2:EGFP)的构建

为了建立一种用于研究肌肉和心脏发育及其相关疾病的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因斑马鱼品系,本研究使用斑马鱼ttn.2基因编码区上游启动子序列和绿色荧光蛋白基因编码序列构建了重组表达载体,并将该载体和Tol2转座酶的加帽mRNA显微共注射入斑马鱼1-细胞期胚胎,通过荧光检测、遗传杂交筛选和分子鉴定等方法,成功建立了能稳定遗传的Tg(ttn.2:EGFP)转基因斑马鱼品系。荧光表达分析及原位杂交分析结果表明,绿色荧光信号在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达模式与ttn.2基因的mRNA表达一致。通过反向PCR鉴定转基因表达载体在F1代斑马鱼品系中的随机整合位点,结果表明:No.33转基因品系的EGFP基因整合在斑马鱼的4号和11号染色体上,No.34转基因品系则整合在1号染色体上。该荧光转基因斑马鱼品系Tg(ttn.2:EGFP)的成功构建为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。此外,绿色荧光强烈表达的斑马鱼品系还可以作为一种新的观赏鱼。