胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene(D16582)的同源性为99.7%。NcoI和HindIII双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白(Marker)相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。

立枯丝核菌AG-1IA对水稻致病力及粗毒素活性的测定方法研究

水稻纹枯病是严重影响水稻生产的真菌病害,水稻相对病斑高度法作为评估立枯丝核菌AG-1 IA致病力的传统方法,需要将水稻培养至分蘖末期或抽穗期,再进行活体接种,耗时耗力,且试验条件不易控制。本研究以水稻相对病斑高度法(活体接种)为对照,利用水稻离体叶鞘法和离体叶片法测定了水稻纹枯病菌致病力和粗毒素活性,比较活体接种法与离体接种法的相关性。结果表明水稻离体叶片法、水稻离体叶鞘法和水稻相对病斑法测定致病力和粗毒素活性结果均呈显著正相关,水稻离体叶片法和离体叶鞘法测定结果能够准确反映立枯丝核菌AG-1 IA的致病力和粗毒素活性,离体评估方法操作方便,试验条件易于控制。因此,水稻离体叶片法、叶鞘法可以替代活体接种法作为测定立枯丝核菌AG-1 IA致病力和粗毒素活性的方法。水稻离体叶片法、叶鞘法与活体接种法结合起来可作为测定立枯丝核菌AG-1 IA毒素活性测定的新方法。本研究的结果还表明,水稻不同组织对水稻纹枯病菌毒素敏感性不同,水稻的叶鞘组织比叶片组织对纹枯病菌敏感。由于粗毒素的致病力与活体菌株接种的致病力存在显著差异,因此纹枯病菌毒素以外的致病因子,也是不容忽视的。在定量分析立枯丝核菌AG-1 IA与水稻的互作中,需要将不同水稻的组织进行区分,才能更加精准地了解互作机制。

抗产气荚膜梭菌ι毒素Phage-ScFv库的构建与筛选

选取经产气荚膜梭菌ι毒素免疫且抗体效价较高的小鼠,提取脾脏mRNA,通过PT-PC技术,分别获得340,325bp的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得大小为750bp的VH-Linker-VL单链抗体基因(ScFv)。利用One Step Cloning Kit试剂盒将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB5E连接,构建库容约为3.5×106抗ι毒素噬菌体初级抗体库。以Ia、Ib为抗原进行Phage-ScFv表面展示文库的5轮亲和富集筛选,最终阳性率均可达70%。选取亲和力最强的3株阳性抗体(Ia-4、Ia-8和Ib1)进行可溶性表达,为ι毒素特异性抗体的大量制备奠定基础,并对产气荚膜梭菌ι毒素感染病例的检测和临床治疗研究具有一定的理论价值和实践意义。