梅毒螺旋体膜脂蛋白Tp0821促炎活性研究

目的探讨梅毒螺旋体(Tp)膜脂蛋白Tp0821潜在的促炎活性及可能参与的信号转导通路。方法表达重组蛋白Tp0821(r Tp0821),去除其中内毒素。r Tp0821刺激THP-1细胞,ELISA检测促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β的表达水平;ERK1/2、JNK、p38和NF-κB特异性抑制剂分别预处理THP-1细胞30 min,再以r Tp0821刺激THP-1细胞,ELISA分别检测IL-6、IL-8和IL-1β的表达水平。结果 r Tp0821刺激THP-1细胞表达IL-6、IL-8和IL-1β在一定范围内与刺激时间以及蛋白浓度呈正相关,1.0μg/m L刺激24 h时各细胞因子表达水平最高;r Tp0821刺激经ERK1/2、JNK、p38和NF-κB特异性抑制剂预处理后的THP-1细胞,IL-6表达水平分别下降63.4%(P<0.001)、4.3%(P>0.05)、53.4%(P<0.001)和73.1%(P<0.0001),IL-8分别下降49.2%(P<0.001)、6.0%(P>0.05)、41.1%(P<0.001)和71.0%(P<0.001),IL-1β分别下降36.8%(P<0.01)、3.9%(P>0.05)、30.3%(P<0.001)和59.7%(P<0.001)。结论 r Tp0821可通过ERK1/2、p38和NF-κB通路诱导THP-1细胞表达促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β,Tp0821可能是Tp重要的致病因子。

梅毒螺旋体四种膜蛋白克隆重组表达和ELISA法建立的应用研究

目的：克隆Tp0821，Tp0319，Tp0971和Tp0663基因，构建原核表达质粒，进行重组蛋白的表达、纯化并用于检测梅毒病人血清抗体，从而探讨Tp0821，Tp0971，Tp0319和Tp0663重组蛋白在 Tp感染诊断中的作用，丰富梅毒血清学诊断的候选抗原库。方法从Tp库中筛选Tp0821，Tp0319，Tp0971和Tp0663四种膜蛋白，通过生物信息学软件分析挑选优势抗原表位，与 pQE32载体进行连接分别构建 pQE32／Tp0821，pQE32／Tp0319，pQE32／Tp0971和 pQE32／Tp0663原核表达重组体；进行体外克隆表达与纯化，并分别以单一的 Tp0821，Tp0319，Tp0971，Tp0663及四种重组蛋白嵌合抗原（Tp0821-Tp0319-Tp0971-Tp0663）为包被抗原建立间接Tp-ELISA方法，以TRUST和TPPA法为对照，检测2013年1月-2014年6月深圳市宝安区人民医院门诊及住院Tp阴性患者160例和 Tp阳性83例临床标本，评价其在梅毒血清学诊断中的应用。结果成功构建原核表达载体 pQE32／Tp0821，pQE32／Tp0319，pQE32／Tp0971和 pQE32／Tp0663；高效表达和纯化出各自相对分子质量的重组蛋白。建立的间接 Tp-ELISA法检测160例 Tp阴性和 8 3例 Tp阳性临床标本，与TPPA相比，敏感度分别为85.5％（71／83），84.3％（70／83），89.2％（74／83），81.9％（68／83）及95.2％（79／83），特异度均为100％（160／160），符合率为82.6％-95.7％。单一的 Tp0821，Tp0319，Tp0971和 Tp0663重组蛋白建立的 TP-ELISA的阳性检出率（85.5％，84.3％，89.2％及81.9％）与 TPPA法的阳性检出率（100％）比较差异有统计学显著性意义（χ^2＝24.5-31.8，P均＜0.01），而四种重组蛋白嵌合抗原建立的 TP-ELISA的阳性检出率与 TPPA法的阳性检出率比较差异有统计学意义（χ^2＝7.95，P＜0.05）。结论制备的 Tp0821，Tp0319，Tp0971和 Tp0663重组蛋白具有良好的免疫活性，为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用奠定一定的基础，但以四种重组蛋白嵌合抗原建立的间接 Tp-ELISA法进行Tp血清学诊断，能提高其检测敏感度。

梅毒螺旋体四种不同膜蛋白在血清学诊断中的应用研究

目的克隆Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663基因,构建原核表达质粒,进行重组蛋白的表达、纯化并用于检测梅毒病人血清抗体。方法从Tp库中筛选Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663四种膜蛋白,通过生物信息学软件分析挑选优势抗原表位,与p QE32载体进行连接分别构建p QE32/Tp0821、p QE32/Tp0319、p QE32/Tp0971和p QE32/Tp0663原核表达重组体;进行体外克隆表达与纯化,并分别以单一的Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663及四种重组蛋白嵌合抗原（Tp0821-Tp0319-Tp0971-Tp0663）为包被抗原建立间接Tp-ELISA方法,以TRUST和TPPA法为对照,检测160例Tp阴性和83例Tp阳性临床标本,评价其在梅毒血清学诊断中应用。结果成功构建原核表达载体p QE32/Tp0821、p QE32/Tp0319、p QE32/Tp0971和p QE32/Tp0663;高效表达和纯化出各自相对分子质量的重组蛋白。建立的间接Tp-ELISA法检测160例Tp阴性和83例Tp阳性临床标本,与TPPA相比,敏感度分别为85.5%（71/83）、84.3%（70/83）、89.2%（74/83）、81.9%（68/83）及95.2%（79/83）,特异度均为100%（160/160）,符合率为82.6%~95.7%。单一的Tp0821、Tp0319、Tp0971和Tp0663重组蛋白建立的TP-ELISA的检出率与TPPA法的检出率（100%）比较差异有显著性统计学意义（χ2=24.5~31.8,P均〈0.01）,而四种重组蛋白嵌合抗原建立的TP-ELISA的检出率与TPPA法的检出率比较差异统计学意义（χ2=7.95,P〈0.05）。结论制备的Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663重组蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用奠定一定的基础,但以四种重组蛋白嵌合抗原建立的间接Tp-ELISA法进行梅毒螺旋体血清学诊断,能提高其检测敏感度。