梅毒螺旋体Tp0971重组蛋白的表达及其在梅毒血清学诊断中的初步评价

目的表达梅毒螺旋体(Tp)重组蛋白Tp0971(rTp0971),评价其作为候选抗原在梅毒血清学诊断中的意义。方法 PCR扩增Tp0971基因,构建原核重组体pET-28a/Tp0971并诱导表达蛋白,Western blot检测表达产物的抗原性;建立rTp0971-ELISA,检测238份TPPA阳性和120份TPPA阴性血清的Tp特异性IgG,并与TPPA法比较。结果成功高效表达了rTp971;Western blot显示纯化的rTp0971能被梅毒患者血清识别。用rTp0971-ELISA检测临床血清标本的特异性为100%,敏感性为89.1%,总符合率为92.7%。结论 rTp0971有较好的抗原性,可望作为梅毒血清学检测的候选诊断抗原。

梅毒螺旋体感染家兔的扩散趋势及感染依赖性抗原Tp0971的免疫保护作用研究

目的探讨梅毒螺旋体(Tp)感染家兔后的扩散趋势及感染依赖性抗原Tp0971的免疫保护作用。方法构建Tp感染家兔模型,连续进行监测并采用定量PCR法检测Tp载量,分析Tp感染家兔后的扩散趋势。用诱导、纯化的Tp0971重组蛋白联合CpG ODNs佐剂免疫家兔(Tp0971组),并设CpG佐剂(对照组)和PBS(空白组)对照。Tp0971组末次免疫2周后接种Tp悬液,记录1个月内3组家兔硬结、溃疡发生情况,定量PCR法检测比较Tp载量,Western blot检测接种皮肤组织炎症细胞因子NLRP3、IL-1β水平。结果Tp感染家兔后皮肤组织出现硬下结和溃疡,Tp载量表达水平表现为降低、升高、再降低、再升高的变化特点。Tp0971组硬结发生时间、硬结最大直径、溃疡发生时间、溃疡发生率及炎症因子NLRP3、IL-1β水平均显著低于对照组和空白组(均P<0.05);Tp0971免疫后家兔组织器官中Tp载量表达受到一定抑制,当接种后14 d时,Tp0971组Tp载量下降、且显著低于对照组和空白组(均P<0.05)。结论家兔感染Tp后表现出和人类梅毒相似的临床症状,且在整个感染过程中各器官组织的Tp载量呈降低、升高的循环反复动态变化;Tp0971免疫对Tp感染家兔临床症状的改善和Tp载量的抑制有一定作用,但不能完全清除宿主体内的Tp。

梅毒螺旋体四种膜蛋白克隆重组表达和ELISA法建立的应用研究

目的：克隆Tp0821，Tp0319，Tp0971和Tp0663基因，构建原核表达质粒，进行重组蛋白的表达、纯化并用于检测梅毒病人血清抗体，从而探讨Tp0821，Tp0971，Tp0319和Tp0663重组蛋白在 Tp感染诊断中的作用，丰富梅毒血清学诊断的候选抗原库。方法从Tp库中筛选Tp0821，Tp0319，Tp0971和Tp0663四种膜蛋白，通过生物信息学软件分析挑选优势抗原表位，与 pQE32载体进行连接分别构建 pQE32／Tp0821，pQE32／Tp0319，pQE32／Tp0971和 pQE32／Tp0663原核表达重组体；进行体外克隆表达与纯化，并分别以单一的 Tp0821，Tp0319，Tp0971，Tp0663及四种重组蛋白嵌合抗原（Tp0821-Tp0319-Tp0971-Tp0663）为包被抗原建立间接Tp-ELISA方法，以TRUST和TPPA法为对照，检测2013年1月-2014年6月深圳市宝安区人民医院门诊及住院Tp阴性患者160例和 Tp阳性83例临床标本，评价其在梅毒血清学诊断中的应用。结果成功构建原核表达载体 pQE32／Tp0821，pQE32／Tp0319，pQE32／Tp0971和 pQE32／Tp0663；高效表达和纯化出各自相对分子质量的重组蛋白。建立的间接 Tp-ELISA法检测160例 Tp阴性和 8 3例 Tp阳性临床标本，与TPPA相比，敏感度分别为85.5％（71／83），84.3％（70／83），89.2％（74／83），81.9％（68／83）及95.2％（79／83），特异度均为100％（160／160），符合率为82.6％-95.7％。单一的 Tp0821，Tp0319，Tp0971和 Tp0663重组蛋白建立的 TP-ELISA的阳性检出率（85.5％，84.3％，89.2％及81.9％）与 TPPA法的阳性检出率（100％）比较差异有统计学显著性意义（χ^2＝24.5-31.8，P均＜0.01），而四种重组蛋白嵌合抗原建立的 TP-ELISA的阳性检出率与 TPPA法的阳性检出率比较差异有统计学意义（χ^2＝7.95，P＜0.05）。结论制备的 Tp0821，Tp0319，Tp0971和 Tp0663重组蛋白具有良好的免疫活性，为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用奠定一定的基础，但以四种重组蛋白嵌合抗原建立的间接 Tp-ELISA法进行Tp血清学诊断，能提高其检测敏感度。

梅毒螺旋体四种不同膜蛋白在血清学诊断中的应用研究

目的克隆Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663基因,构建原核表达质粒,进行重组蛋白的表达、纯化并用于检测梅毒病人血清抗体。方法从Tp库中筛选Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663四种膜蛋白,通过生物信息学软件分析挑选优势抗原表位,与p QE32载体进行连接分别构建p QE32/Tp0821、p QE32/Tp0319、p QE32/Tp0971和p QE32/Tp0663原核表达重组体;进行体外克隆表达与纯化,并分别以单一的Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663及四种重组蛋白嵌合抗原（Tp0821-Tp0319-Tp0971-Tp0663）为包被抗原建立间接Tp-ELISA方法,以TRUST和TPPA法为对照,检测160例Tp阴性和83例Tp阳性临床标本,评价其在梅毒血清学诊断中应用。结果成功构建原核表达载体p QE32/Tp0821、p QE32/Tp0319、p QE32/Tp0971和p QE32/Tp0663;高效表达和纯化出各自相对分子质量的重组蛋白。建立的间接Tp-ELISA法检测160例Tp阴性和83例Tp阳性临床标本,与TPPA相比,敏感度分别为85.5%（71/83）、84.3%（70/83）、89.2%（74/83）、81.9%（68/83）及95.2%（79/83）,特异度均为100%（160/160）,符合率为82.6%~95.7%。单一的Tp0821、Tp0319、Tp0971和Tp0663重组蛋白建立的TP-ELISA的检出率与TPPA法的检出率（100%）比较差异有显著性统计学意义（χ2=24.5~31.8,P均〈0.01）,而四种重组蛋白嵌合抗原建立的TP-ELISA的检出率与TPPA法的检出率比较差异统计学意义（χ2=7.95,P〈0.05）。结论制备的Tp0821、Tp0319、Tp0971、Tp0663重组蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用奠定一定的基础,但以四种重组蛋白嵌合抗原建立的间接Tp-ELISA法进行梅毒螺旋体血清学诊断,能提高其检测敏感度。