老年可疑梅毒患者血清Tp15,Tp17,Tp45和Tp47抗体表达分析

目的分析老年可疑梅毒患者血清Tp15,Tp17,Tp45和Tp47抗体表达特征。方法性病门诊收集24例梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)阳性的老年可疑梅毒患者,同时收集35例老年二期梅毒患者和22例治疗10年以上的老年梅毒患者作为对照组,采用欧盟免疫印迹法检测各组患者血清抗梅毒螺旋体Tp15,Tp17,Tp45和Tp47 IgG表达情况。结果二期梅毒患者4种螺旋体特异性抗体均阳性。与老年二期梅毒患者相比,治疗10年以上的老年梅毒患者Tp17和Tp47 IgG抗体表达下降(P均<0.001);老年可疑梅毒患者与治疗10年以上的老年梅毒患者血清Tp15,Tp17,Tp45和Tp47 IgG抗体表达差异无统计学意义(P均>0.05)。结论梅毒治疗后Tp17和Tp47 IgG抗体表达下降;TPPA阳性的老年可疑患者可能是早年感染的梅毒患者。

重组梅毒螺旋体蛋白Tp47通过诱导uPA增加血管内皮细胞通透性

目的探讨重组梅毒螺旋体蛋白Tp47(rTpp47)对单核-巨噬细胞系THP-1合成尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的调控及其对人脐静脉/血管内皮细胞(HUVECs)通透性的影响。方法用rTpp47刺激THP-1细胞24 h后,分别收集细胞培养上清和THP-1细胞,用ELISA和Western blot检测THP-1细胞表达的uPA含量;用THP-1细胞培养上清刺激人单层血管内皮细胞后,使用FITC-葡聚糖评价单层内皮细胞通透性的变化,用Western blot检测uPA对HUVECs细胞紧密连接蛋白claudin-5表达的影响以及PKC信号通路是否参与rTpp47诱导的THP-1细胞表达uPA。结果重组蛋白rTpp47刺激THP-1细胞合成和分泌的uPA显著高于对照组(P<0.05,P<0.001);用rTpp47与THP-1细胞共培养24 h后收集的细胞培养上清刺激单层血管内皮细胞12和24 h,实验组血管内皮细胞相对通透性显著高于对照组(P<0.05,P<0.0001);uPA活性抑制剂阿米洛利(amiloride)抑制了rTpp47刺激THP-1细胞分泌uPA(P<0.0001),改善了rTpp47对HUVECs的claudin-5蛋白表达的抑制作用(P<0.05),抑制了rTpp47诱导的THP-1细胞表达蛋白激酶C(PKC)的磷酸化(P<0.05)。结论重组蛋白rTpp47可能通过激活PKC信号通路刺激THP-1细胞合成和分泌的uPA,uPA作用于血管内皮细胞,可能导致血管内皮细胞通透性升高。

梅毒密螺旋体Tp47重组蛋白的表达及其应用

目的 在大肠埃希菌中表达梅毒密螺旋体 (Treponemapallidum ,Tp)Tp47重组蛋白 ,用其建立诊断梅毒的酶联免疫法 (enzymeimmunoassay ,EIA)。 方法 应用聚合酶链反应法 (PCR)从Tp全基因组中扩增目的片段Tp47,并将其克隆到表达载体 pET - 3 0a中 ,构建重组质粒pET - 3 0a -Tp47。在大肠埃希菌中表达重组蛋白Tp47,亲和层析柱纯化 ,建立EIA法 ,检测血清中抗 -Tp抗体。 结果 获得了Tp47基因重组蛋白的高效表达 ,该重组蛋白存在于细菌上清中 ,占全菌体蛋白 12 %左右 ,分子量约 3 9kDa。蛋白印迹法 (westernblot,WB)显示 ,Tp47重组蛋白具有良好的抗原性。用Tp47重组蛋白建立EIA法 ,检测 11份梅毒血凝试验阳性和 2 8份阴性血清 ,灵敏度为 10 0 % (11/ 11) ,特异性为 96 4% (2 7/ 2 8)。

梅毒螺旋体Tp0453缩短抗原和Tp47抗原在不同期梅毒检测中的应用比较

目的:比较梅毒螺旋体Tp0453缩短抗原(Tp0453-s)和Tp47抗原在不同期梅毒检测中的应用。方法:表达并纯化Tp47抗原,进行SDS-PAGE电泳和western blot鉴定。western blot检测比较Tp0453-s和Tp47抗原在不同期梅毒患者检测中的阳性率。结果:Tp47和Tp0453-s 2种抗原均可与一期、二期和三期梅毒患者血清发生反应,而与非梅毒病人血清无交叉反应性。Tp0453-s和Tp47抗原与隐性梅毒患者的血清反应阳性率分别为55.6%(10/18)和94.4%(17/18),差异具有统计学意义(x2=7.26,P<0.01)。结论:Tp0453-s和Tp47两种抗原与各期梅毒患者血清反应性良好,但在隐性梅毒检测方面Tp47比Tp0453-s更具有优势。

TP47蛋白在梅毒血清学诊断中的应用

目的采用原核基因工程技术重组表达梅毒螺旋体TP47蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法 PCR扩增获得TP47基因片段并构建pET28b-TP47原核表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达,经镍柱纯化后通过质谱技术进行鉴定。采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性。建立基于重组TP47抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和75份TPPA阴性血清进行方法学验证。结果 PCR扩增获得约1.1kb的基因片段,成功构建原核表达载体pET28b-TP47。重组蛋白在细菌中以包涵体形式表达,约占菌体蛋白含量的70%,分子量约39000Mr,经纯化后其纯度约95%。经质谱分析表明重组蛋白为TP47蛋白。免疫印迹法证实TP47蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性反应,ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为97%(29/30)和97%(73/75)。结论通过DNA重组技术成功获得了梅毒螺旋体TP47蛋白,证实其与梅毒阳性血清具有良好的反应性,为研发新一代梅毒感染诊断试剂盒奠定了基础。

化学发光法检测孕妇梅毒螺旋体抗体假阳性探讨

目的利用化学发光法(CLIA)初筛孕妇的梅毒螺旋体(TP)抗体,对假阳性标本用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TP特异性抗体的3种基因(TP15、TP47、TP17)片段,分析引起假阳性的抗体基因片段。方法选择32份CLIA检测孕妇TP抗体假阳性、而产后6个月后再次进行TP抗体检测为阴性的标本作为假阳性组,同时随机选取32份确证为TP抗体阳性的孕妇标本作为真阳性组。采用ELISA检测两组TP特异性抗体3种基因(TP15、TP47、TP17)片段。分析假阳性组TP抗体表达情况,比较两组抗体基因片段检测结果。结果32份假阳性组孕妇TP抗体检测阳性标本的截断指数(COI)值为1.03~6.09,其中29份标本梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)为阴性,3份标本TPPA为阳性,稀释倍数在1∶80内,产后6个月后复检TP与TPPA均为阴性。假阳性组TP检测阳性标本采用单基因片段包被TP15、TP17与TP47抗原检测相应的抗体,TP15均为阴性,TP17阳性6份,TP47阳性22份;产后6个月后复查TP、TPPA、TP15、TP17与TP47均为阴性。真阳性组标本中,TP15阳性20份,TP17阳性26份,TP47阳性11份。假孕妇组孕期TP17、TP47阳性率分别为18.75%(6/32)、68.75%(22/32),高于本组产后6个月的0、0,差异具有统计学意义(χ^(2)=6.621、33.524,P=0.010、0.000<0.05)。假阳性组孕期TP15阳性率0、TP17阳性率18.75%(6/32)低于真阳性组的62.50%(20/32)、81.25%(26/32),TP47阳性率68.75%(22/32)高于真阳性组的34.38%(11/32),差异具有统计学意义(χ^(2)=29.091、25.000、7.570,P=0.000、0.000、0.006<0.05)。结论TP47基因片段是引起孕妇TP假阳性的主要原因,为下一步改进多基因重组抗原试剂盒的特异性以及研发单独包被TP47重组基因片段抗原的试剂盒提供依据,避免不必要的因素引起孕妇各种心身、家庭与社会压力。

TP-ELISA试剂盒3种外膜脂蛋白抗原联合应用对检测结果影响分析

目的通过对大连地区无偿献血者梅毒单试剂阳性和双试剂阳性血清标本中TP15、TP17、TP47抗体分别进行检测,分析梅毒A试剂所包被的这3种不同外膜脂蛋白抗原对检测结果的影响。方法收集大连市血液中心2017年11月—2018年11月梅毒A试剂单阳性标本36份和171份TP双试剂阳性标本,采用A试剂厂家3种分别包被不同外膜脂蛋白抗原的TP-ELISA试剂进行检测,所有阳性标本都进行电化学发光和TPPA确证实验,记录结果,并对数据进行统计分析。结果 1)TP单试剂阳性(A厂家)和双试剂阳性标本进行确认实验后,假阳性率分别为100%和10.83%(P<0.05)。2)单试剂阳性(A厂家)标本36份,3种抗体检测结果筛查频率P分别为:TP15-,TP47-,TP17-(P=0.17);TP15+,TP47-,TP17-(P=0.22);TP15-,TP47+,TP17-(P=0.56);TP15-,TP47-,TP17+(P=0.06);TP15+,TP47+,TP17-、TP15-,TP47+,TP17+、TP15+,TP47-,TP17+、TP15+,TP47+,TP17+频率P均为0。3)梅毒双试剂阳性标本(确认阳性)140份,3种抗体检测结果筛查频率P分别为:TP15+,TP47-,TP17-(P=0.01);TP15-,TP47+,TP17-(P=0.01);TP15+,TP47+,TP17-(P=0.04);TP15-,TP47+,TP17+(P=0.01);TP15+,TP47-,TP17+(P=0.01);TP15+,TP47+,TP17+(P=0.92);TP15-,TP47-,TP17-和TP15-,TP47-,TP17+频率P为0。4)梅毒单阳性的标本3种抗体检测结果两两进行χ~2配对检验,TP17和TP47 2种抗体的阳性检出率有差异(P<0.05);TP17和TP15 2种抗体的阳性检出率无差异(P>0.05);TP15和TP47 2种抗体的阳性检出率有差异(P<0.05)。5)梅毒双试剂阳性的标本(确认阳性)3种抗体检测结果两两进行χ^2配对检验均无差异(P>0.05)。结论 TP-ELISA检测试剂A包被的TP47外膜脂蛋白可能是引起其假阳性率升高的主要原因,针对TP47外膜脂蛋白在梅毒检测试剂A中的应用价值试剂厂家应该进行进一步的研究。

多表位融合蛋白对减少梅毒抗体测定假反应性的作用

目的针对梅毒低流行率人群,采用多表位融合片段策略以提高苍白密螺旋体(Tp)筛查试验的特异度,减少Tp假反应性结果。方法通过原核表达系统获得包含Tp47蛋白多个优势B细胞表位的多表位融合蛋白。随后将该多表位融合蛋白作为抗原用于建立双抗原夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法并检测96份梅毒阳性血清(1≤S/CO≤10)。将梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)结果作为标准,将多表位融合蛋白的灵敏度和特异度与Tp47蛋白进行比较。结果多表位融合蛋白双抗原夹心ELISA法检测的灵敏度和特异度分别为90.32%和94.12%,Tp47蛋白双抗原夹心ELISA法检测的灵敏度为93.55%,特异度较低,为79.41%。多表位融合蛋白双抗原夹心ELISA法与TPPA结果的符合率为91.67%,高于Tp47蛋白的88.54%。结论多表位融合蛋白可有效提高梅毒血清学诊断的特异度。该研究为开发新一代具有较高特异度的梅毒诊断方法提供了思路。

梅毒螺旋体47ku抗原的分段表达及抗原表位分析

通过大肠杆菌表达系统表达了梅毒螺旋体47 ku膜蛋白及其N端和/或C端缺失的重组蛋白共15个,经亲和层析纯化,并通过免疫印迹和酶联免疫实验检测这组蛋白与梅毒病人血清的反应性.结果发现所有包含D结构域的重组蛋白的免疫反应性显著高于不含D结构域的蛋白,提示D结构域中可能包含47 ku膜蛋白上的一个免疫优势表位.

线形免疫分析方法检测一二期梅毒病人TP相关抗体

目的了解梅毒螺旋体(TP)外膜脂蛋白抗原TP15、TP17、TP42、TP47相关特异性抗体,在一期和二期梅毒病人血清中的检出状况,评价其在早期梅毒血清学诊断应用的意义。方法用线性免疫分析(Lineimmunoas-say)方法对24例一期梅毒病人,54例二期梅毒病人的血清进行检测,分析TP15、TP17、TP42、TP47相关特异性抗体与临床特征及传统血清学方法检测结果的关系。结果一期梅毒病人血清中,TP15、TP17、TP42、TP47的抗体阳性率分别为29.2%、100.0%、91.7%和95.8%,二期梅毒病人血清中TP15抗体阳性率为87.0%,TP17、TP42和TP47抗体均为100.0%。结论梅毒螺旋体外膜脂蛋白抗原特异性抗体产生与感染时间相关,TP17抗体出现最早,在一期和二期梅毒病人血清中,TP42和TP47抗体也均有高的阳性率,TP15抗体在二期梅毒病人血清中的阳性率较一期梅毒病人显著增高。

梅毒包膜脂蛋白基因的克隆、表达及临床抗体的检测

目的:克隆tp15、tp17、tp47、tp0453基因,构建原核表达质粒,进行蛋白的表达、纯化并用于检测梅毒病人血清抗体。方法:PCR扩增4个基因,构建原核表达质粒pET28a(+)/tp15、pET28a(+)/tp17、pGEX-6P-1/tp47和pGEX-6P-1/tp0453,经双酶切及测序鉴定,将获得的阳性克隆转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳及Western blot分析鉴定,利用亲和层析方法对4个蛋白进行纯化。将四个纯化的蛋白固定到NC膜上,利用immuno-slot blot方法对梅毒病人血清进行检测。结果:经鉴定表明成功构建四个原核表达质粒。SDS-PAGE电泳及Western blot分析结果显示四个重组蛋白大小正确。immuno-slot blot实验显示四个蛋白能与梅毒病人血清特异性结合。结论:成功克隆、表达和纯化了tp15、tp17、tp47、tp0453蛋白,四个蛋白可以与梅毒病人血清特异性结合,为进一步建立梅毒病人血清检测试剂盒奠定基础。