TALENs技术在基因功能研究中的应用

基因敲除技术广泛应用于研究各类细胞和生物的基因功能。转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALENs)是近年发展起来的一种新型基因敲除方法,其利用TALEs蛋白核酸结合域氨基酸序列与其靶位点核酸序列之间存在着恒定对应关系,从而组装出能特异性结合任意DNA序列的模块化蛋白。TALENs技术以其快速、高效的优势对生物基因研究领域产生深远影响,为遗传疾病的治疗提供了新的策略。

6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3基因敲除小鼠模型的构建

目的建立6-磷酸果糖激酶-2／果糖双磷酸酶-2同工酶3（PFKFB3）基因敲除小鼠模型。方法利用类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术，通过构建针对PFKFB3基因的TALEN质粒，并将构建好的TALEN质粒在体外反转录为mRNA。利用原核显微注射分别将0．1μl转录后的浓度为50ng／山的mRNA注射到C57BL／6品系小鼠受精卵中，将受精卵回送到ICR代孕母鼠输卵管中，得到F0代基因敲除杂合子小鼠。将FU代饲养至10周龄后合笼，从而构建基因敲除纯合子小鼠。所有子代鼠出生1周后剪尾，提取RNA后反转录，PCR产物作为模板进行基因测序鉴定基因型。结果通过TALEN技术成功构建了f1D代基因敲除杂合子小鼠3只，基因测序结果表明分别于靶基因位置缺失了10、4、1对碱基对；因PFKFB3基因敲除纯合子具有胚胎致死性，6只F1代基因敲除小鼠的基因测序结果显示，针对靶基因，编号4、5的小鼠缺失了1对碱基对，6号小鼠缺失4对碱基对，7、8、9号小鼠缺失10对碱基对。结论成功构建了PFKFB3基因敲除杂合子（＋／-）小鼠．。