碱性成纤维细胞生长因子转染对半月板纤维软骨细胞增殖、细胞周期及胶原合成影响的研究

目的探索携带碱性成纤维细胞生长因子(bas ic fibrob last grow th factor,bFGF)基因的重组慢病毒载体转染半月板纤维软骨细胞的效能,观察半月板纤维软骨细胞对bFGF基因转染的反应。方法将从1只3月龄新西兰大白兔分离培养的第1代半月板纤维软骨细胞分为实验组(A组)、对照组(B组)和空白组(C组),3组细胞分别以2×104个/孔接种于24孔培养板。细胞生长至60%融合时,A组与克隆有bFGF基因的重组慢病毒载体悬液共培养,B组与不携带任何基因的慢病毒悬液共培养,C组未接受外加处理。共培养48 h后检测3组的细胞周期、胶原合成能力、培养液中bFGF的表达及不同时间各组细胞的细胞增殖能力的变化。结果共培养48 h后在A组测出bFGF浓度为870±60 pg/m l,而B、C组培养液中未能检测出bFGF的表达;共培养6 d后,M TT法检测,A组吸光度(A)值0.427±0.037与B组0.320±0.042和C组0.308±0.034比较差异有统计学意义(P<0.01)。A组细胞周期较B、C组缩短,A组细胞G1期,S期和G2/M期的时间分别为16.28、12.60和11.04 h;而B、C组分别为23.61、16.90和21.33 h及21.56、19.80和21.41 h;A组与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。A组细胞每分衰变数(7 281.69±805.50)高于B组(5 916.40±698.11)和C组(5 883.57±922.63),比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论借助慢病毒载体能有效实现bFGF基因在半月板纤维软骨细胞的转染;bFGF基因转染能促进半月板纤维软骨细胞的增殖和胶原合成能力。

KISS-1对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制作用

目的探讨KISS-1基因对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响。方法通过脂质体介导将pc DNA3.1-KISS-1转染人胃癌细胞BGC-823,用Western blot检测转染前后KISS-1蛋白的表达。将转染pc DNA3.1-KISS-1的BGC-823细胞(转基因组)、转染空质粒的BGC-823细胞(空质粒转染组)和单纯BGC-823细胞(对照组)分别接种于BALB/C裸鼠,构建裸鼠胃癌移植瘤模型,测量肿瘤体积和瘤质量,并绘制肿瘤生长曲线;采用免疫组织化学法和半定量反转录-聚合酶链反应检测肿瘤组织中KISS-1蛋白和mRNA的表达。结果 KISS-1基因成功转入胃癌BGC-823细胞,转基因组KISS-1蛋白的表达较空质粒转染组和对照组显著增加(P<0.05);与空质粒转染组和对照组比较,转基因组裸鼠肿瘤生长速度显著减慢、肿瘤体积显著减小,瘤体质量显著减轻(P<0.05)。结论通过基因转染的方法能表达有活性的KISS-1,并能抑制裸鼠胃癌移植瘤的生长。

双启动子shRNA表达载体对hTERT和bcl-2基因表达的抑制作用

目的:研究双启动子shRNA表达载体对人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)基因表达的抑制作用。方法:分别从构建好的大肠杆菌DH5α菌体中提取含有双启动子shRNA的表达载体pdPRO-TB、单启动子对照pdPRO-T、pdPRO-B和阴性对照质粒pdPRO,通过脂质体介导瞬时转染Hela细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。实时荧光定量RCR检测hTERT和bcl-2基因的表达水平。结果:4种菌体中均提取出5 000 bp左右的质粒,分别转染Hela细胞48 h后,可见转染pdPRO的Hela细胞形态无明显变化,转染pdPRO-T和pdPRO-B的Hela细胞有部分悬浮,转染pdPRO-TB的Hela细胞有大量悬浮。各载体质粒构建均成功,各目的基因相对管家基因的含量:T(hTERT)=39.8%,B(hTERT)=107.9%,TB(hTERT)=32.1%;T(bcl-2)=91.4%,B(bcl-2)=35.4%,TB(bcl-2)=31.4%。结论:双启动子shRNA表达载体构建成功,可同时抑制hTERT和bcl-2基因的表达。

RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞α7神经型尼古丁受体基因的表达

目的:利用小分子干扰RNA(RNA i)技术抑制神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中α7神经型尼古丁受体(nAChR)基因的表达,并研究α7 nAChR基因表达受抑制后对细胞存活率及脂质过氧化水平的影响。方法:设计并通过分子生物学方法合成α7 nAChR基因特异性小分子干扰RNA(siRNA),转染SH-SY5Y细胞,培养48h后收集细胞,分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和西印迹方法(W estern-b lotting)检测转染细胞中α7nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化,并用1μmol/Lβ淀粉样肽25-35(Aβ25-35)处理siRNA转染细胞,比色法测定脂质过氧化产物含量。四氮基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞活力。结果:转染siRNA后,与对照组相比,实验组α7 nAChR mRNA及蛋白表达量降低,抑制率分别为52%和36%,脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,MTT法表明实验组细胞活力明显低于对照组,且能增强Aβ的细胞毒性作用。结论:特异性siRNA能有效抑制α7 nAChR基因的表达,α7 nAChR基因的表达的抑制能增加Aβ的神经毒性作用,间接说明α7 nAChR有一定的神经保护作用,其表达减少与阿尔茨海默病的发生有一定关系。

人NKp30基因克隆及其真核表达载体的构建

目的对人NKp30(hNKp30)进行基因克隆并在大肠埃希菌中重组表达,为进一步研究NK细胞抗肿瘤作用奠定基础。方法提取人外周静脉血单个核细胞,分离纯化外周血总RNA。用PCR扩增hNKp30片段,克隆至质粒载体pMD18-T,对克隆的DNA片段行序列分析。用限制酶XhoI、EcoRI消化pMD18-T-hNKp30重组质粒,分离hNKp30片段,插入真核表达载体pIRES2-EGFP相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pIRES2-EG-FP-hNKp30,并转染COS-7细胞。结果PCR扩增DNA片段与hNKp30 cDNA大小一致。重组质粒pMD18-T-hNKp30的DNA序列分析显示,克隆DNA序列与文献报道hNKp30的cDNA序列一致。重组表达质粒pIRES2-EGFP-hNKp30转染COS-7细胞后,实现了hNKp30基因在COS-7细胞中的体外转染及瞬时表达。结论采用重组技术成功构建了hNKp30真核表达载体,为探讨NK细胞受体的特性及其信号转导机制奠定了基础。

SEA诱导人PBMC对结肠癌Caco-2细胞的杀伤效果观察

目的通过蛋白注入和基因转染两种形式,观察金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导人外周血单核细胞(PBMC)对结肠癌Caco-2细胞的杀伤效果。方法密度梯度离心法分离PBMC,用不同浓度SEA诱导;MTT法测定PBMC对Caco-2细胞的杀伤率;用阳离子脂质体法将重组质粒pEGFP-N1-SEA转染至Caco-2细胞,检测PB-MC对该细胞的杀伤率。结果在一定范围内,随着SEA浓度的升高,PBMC对Caco-2细胞的杀伤率显著上升,在36h、高效靶比、高SEA浓度的情况下,杀伤率可达57.23%;将pEGFP-N1-SEA转染至Caco-2中,转染效率达55%,同时能显著提高PBMC的杀伤率,转染60h后杀伤率可达54.62%。结论通过蛋白注入和基因转染两种形式,SEA均能诱导并增强PBMC对Caco-2细胞的杀伤效果。

人类GAD67基因转染骨髓基质源性神经干细胞及初步检测

目的利用转基因技术将人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因转染骨髓基质源性神经干细胞仍MSCs-D-NSCs），获得GAD67修饰的成体专能干细胞。方法以PCR、双酶切及测序鉴定pEGFP-C2-GAD67和pcDNA3.1-GAD67重组子；利用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs并促其向NSCs方向分化，将编码人类GAD67基因的真核表达质粒pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3．1-GAD67分别转染BMSCs-D-NSCs，荧光显微镜下观察并用流式细胞仪检测转染效率。结果pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD6，均可扩增出约1800bp目的条带，经双酶切和基因测序证实。荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光细胞，两种载体转染效率分别为39.3％和40.5％。结论pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67真核表达载体重组正确，利用脂质体介导人类GAD6，基因能有效转染BMSCs-D-NSCs，为进一步观察其GAD67基因和蛋白的表达提供了前提条件。