哈茨木霉LTR-2对椒样薄荷耐盐生理特性的影响

木霉菌(Trichoderma spp.)是一类能够刺激作物生长并增强其抵抗生物和非生物胁迫能力的多功能益生真菌,目前国内外对于生防木霉菌在增强植物耐盐性及其作用机理方面尚缺乏深入、系统的研究。本文研究了生防木霉菌LTR-2对椒样薄荷耐盐生理特性的影响,结果显示,在200 mmol/L NaCl胁迫下,LTR-2有效缓解了盐胁迫对椒样薄荷的生长和光合的抑制。探讨了LTR-2接种的椒样薄荷耐受NaCl胁迫的生理生化基础,结果表明,LTR-2提高了椒样薄荷的抗氧化活力,减少了活性氧积累;增强了细胞膜和液泡膜H+-ATPase以及Na+/H+逆向转运蛋白等离子转运通道的活性,从而调节盐分的吸收和分布。这些结果为椒样薄荷在盐碱地区的引种及木霉菌剂的开发应用提供了实验依据。

哈茨木霉LTR-2双价基因重组菌株的构建及其防治效果

本文利用限制性内切酶介导法转化哈茨木霉LTR-2,获得具有双价基因(glu14、chi42)的重组生防菌株。试验得到的木霉转化子具有遗传稳定性,于无药PDA平板上连续转接6次后,在Hyg 200μg/m L的PDA平板上仍可继续生长。PCR扩增及Southern杂交证实目的基因已随机插入木霉基因组DNA上,本试验转化子均为单拷贝插入。转化子的β-1,4-葡聚糖酶和几丁质酶水解活性较出发菌株LTR-2显著提高(P<0.01),其中转化子L-15的两种水解酶活性均最高。转化子在温室条件下对番茄晚疫病、茄子猝倒病和黄瓜灰霉病均有较好的防治作用,但不同处理间存在显著性差异(P<0.01),其中转化子L-15最高,对3种病害的防治效果分别达到了91.5%、94.9%和83.8%,较出发菌株LTR-2处理分别提高了53.5%、55.9%和33.5%。结果表明,利用REMI技术,将β-1,4-葡聚糖酶基因glu14和几丁质酶基因chi42重组到木霉染色体DNA上,是获得高效重组菌株的有效手段。

哈茨木霉重组株L-15与野生株LTR-2贮存稳定性及生防活性研究

为比较哈茨木霉重组株L-15与野生株LTR-2在贮存稳定性及生防活性方面的差异,采用平板菌落计数法检测木霉可湿性粉剂中分生孢子的存活率,测定菌株的生物学特性,并在温室条件下评价制剂对番茄立枯病的防治效果。结果表明,分生孢子存活率达80.0%时,在5℃和室温(2℃~36℃)下,L-15可湿性粉剂的货架期分别为24个月和9个月,显著高于LTR-2可湿性粉剂的12个月和6个月。L-15的潮霉素抗性在贮存后稳定遗传,其β-1,4-葡聚糖酶水解活性、几丁质酶水解活性及平板拮抗活性较LTR-2明显提高。5℃贮存60月后,L-15可湿性粉剂10×和100×稀释处理对番茄立枯病的温室防治效果分别达89.27%和86.52%,与LTR-2处理间存在极显著性差异(P<0.01)。重组株L-15的货架期和生防活性较野生株LTR-2明显提高,在生物防治领域具有潜在应用价值。

哈茨木霉T_2菌株提取物对齐整小核菌抑菌活性的测定

采用甲醇法、乙醇法、超声波水法、碱法等4种方法对哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)T2菌株分生孢子中的抗菌物质进行了提取,并测定了各种粗提物对齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的抑菌活性及温度对粗提物抑菌活性的影响.结果表明,用不同方法提取的哈茨木霉T2菌株粗提物对齐整小核菌有不同程度的抑制效果,其中以超声波水法提取物对齐整小核菌的抑制效果较好,温度对粗提物的抑菌活性有明显的影响.

拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件优化

【目的】优化拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件,快速、高效获得绿色荧光标记菌株,为哈茨木霉及同类真菌的GFP标记提供参考,并为下一步研究其在不同环境中的定殖动态、分布规律及生防特性等打下基础。【方法】采用PEG-Ca Cl2介导的原生质体转化体系,从木霉菌株的菌龄、酶解时间、转化体系中质粒的含量及再生培养基中潮霉素B(Hm B)的浓度等方面对哈茨木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件进行优化,获得表达稳定的转化子,并与出发菌株的生长特性进行比较,评价转化效果。【结果】gz-2菌株培养36 h菌丝所形成的原生质体稳定性最好,菌丝体酶解3.5 h获得的原生质体数量最多,达11.67×106个/m L;每240μL转化体系中质粒DNA含量为40μL,得到的转化子数量最多,为8.67个/皿;再生培养基中Hm B含量为600μg/m L时可获得稳定的强转化子。【结论】筛选获得1株表达稳定的转化子GFP-gz-2菌株,该菌株在菌落形态、菌丝生长速率及产孢量上与出发菌株gz-2无显著差异,且具有较好的遗传稳定性。

玉米茎腐病生防菌哈茨木霉CCTH-2鉴定及其生物学特性

玉米茎腐病(CSR)对玉米产量和品质危害巨大。为尽快展开玉米茎腐病的有效防治,将吉林省玉米茎腐病的优势致病菌禾谷镰孢,与14株从玉米根际土壤中分离得到木霉菌株分别进行平板对峙试验。观察木霉对禾谷镰孢的抑制作用,筛选得到抑制效果较好的菌株CCTH-2和CCTH-6。复筛通过这2株木霉的发酵液、易挥发性代谢产物、难挥发性代谢产物对禾谷镰孢的抑制效果和对其他病原真菌的抑制效果,最终筛选到一株具有良好防效的木霉菌株CCTH-2;CCTH-2经过形态学和分子生物学鉴定显示,为哈茨木霉,并对其生物学特性进行初步研究。结果表明,平板对峙培养条件下CCTH-2对禾谷镰孢抑制率为82.83%,其发酵液、易挥发代谢物和难挥发代谢物对禾谷镰孢的抑制率为36.56%,46.75%,32.48%,具有显著抑制效果。生物学特性试验显示,CCTH-2菌落生长和产孢的最适培养基为PDA,最适温度为25℃,最适光照条件为全光照,外源添加Fe^(2+)有利于CCTH-2的生长发育,并且CCTH-2具有一定的适应环境酸碱度和盐含量变化的能力。因此,可以确认哈茨木霉CCTH-2是一株有着良好防效且潜力巨大的生防菌。

外源赤霉素与氯化钙对哈茨木霉生长的影响

为了解赤霉素(GA_(3))和钙离子对哈茨木霉生长的影响,本试验在PDA培养基中添加不同质量浓度的GA_(3)和CaCl_(2),观测培养24 h和36 h菌落直径的变化。结果表明,添加GA_(3)对木霉菌落直径增加有明显促进作用,其中培养24 h后,0.8 mg/L的GA_(3)处理下哈茨木霉菌的直径是对照的1.42倍。在处理36 h时,0.2 mg/L的GA_(3)处理下哈茨木霉菌的直径是对照的1.35倍。添加外源CaCl_(2)时对哈茨木霉菌生长的促进效果较小,培养36 h后,钙离子质量浓度为0.2 mg/L时可促进哈茨木霉菌生长,此时培养基中菌落直径是对照的1.08倍。

木霉对草酸耐受和消除作用的初步分析

【目的】草酸(Oxalic acid,OA)是灰霉菌(Botrytis cinerea)等植物致病菌的致病因子,一些木霉(Trichoderma spp.)生防菌可消除草酸并降低植物发病率,但其消除草酸防治病害的途径和机制尚未研究透彻。【方法】首先从42株木霉菌株中筛选出一株在30 mmol/L草酸胁迫下耐受性最强的哈茨木霉T.harzianum LTR-2,通过形态学方法观察和原位分析了不同浓度草酸胁迫下LTR-2的发育特征变化,并测定了草酸消除水平、滤液p H和菌丝干重,分析了LTR-2在草酸为唯一碳源的生长情况。通过Real-time PCR分析了OXDC基因LTR_4445在草酸处理下的表达水平。【结果】在PDA固体培养基中,25°C半光照条件下培养5 d,在草酸浓度为50-80 mmol/L时,LTR-2可存活,但无正常菌落形态;在30-50 mmol/L浓度下,LTR-2先萌发厚垣孢子,而后再次萌发菌丝形成菌落;在<30 mmol/L浓度下,LTR-2发育正常,仅生长速度减缓。25°C、160 r/min振荡培养5 d,LTR-2可消除草酸。在20 mmol/L浓度时,草酸消除率最高,为66.50%;10 mmol/L浓度中的消除率次之,为55.06%。草酸浓度>50 mmol/L时,消除能力下降为6.75%-38.94%。相应地,培养液p H被不同程度地提高,在10、20 mmol/L草酸浓度下提高的幅度更大。当草酸浓度<20 mmol/L时,木霉的菌丝干重有不同程度的提高。将草酸作为唯一碳源进行液体培养5 d时,在10、20 mmol/L浓度下,LTR-2可形成肉眼可见的绿色菌丝球,但高于50 mmol/L条件下无法生长。草酸处理下,LTR_4445表达水平上调。【结论】通过分析LTR-2在草酸胁迫条件下的形态特征变化及消除草酸的特性,暗示在木霉消除草酸作用中除了已知的草酸降解代谢途径,还存在响应草酸胁迫模式的转变、将草酸作为前体转化为营养物质的途径等其他消除途径。