拟南芥TRX-h5基因的克隆和表达分析

硫氧还蛋白(TRX-h)是一类催化二硫键还原的小分子蛋白,在调控氧化应激响应中发挥重要作用。为了研究硫氧还蛋白的结构及其功能,文章以野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia(Col-0)为研究材料,通过反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术获得TRX-h5基因的编码序列(coding sequence,CDS),体外构建pET28a(+)-TRX-h5及pET28a(+)-TRX-h5M(第39位和第42位半胱氨酸位点突变)的原核表达载体,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,诱导后经镍柱纯化得到带有6个His标签的融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳技术检测到14 kDa处的目的条带,与理论值预测一致。运用生物信息学分析得出,TRX-h5基因编码118个氨基酸,相对分子质量为13122.32,理论等电点为5.19,该蛋白的不稳定参数为26.74,属于稳定性蛋白。点突变分析发现,TRX-h5的第39位和第42位半胱氨酸位点决定了该蛋白的催化活性,为进一步探究TRX-h5的蛋白功能和高等植物氧化还原系统的研究提供了新思路。

小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体的构建和自激活检测

为构建小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体,并检测其对酵母细胞的自激活作用。利用RT-PCR扩增TaTrx-h基因的ORF区域,并与pGBKT7载体连接构建诱饵载体pGBKT7-Trx-h,利用PEG/LiAC法转化酵母AH109后,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无自激活作用。结果表明,含pGBKT7-Trx-h质粒的酵母在SD/-Trp-Leu培养基上能正常生长,说明诱饵载体表达产物对酵母细胞无毒性作用;在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上不能生长,说明诱饵质粒无自主激活报告基因的作用。因此,可以利用该诱饵载体通过酵母双杂交方法筛选与Trxh蛋白相互作用的蛋白。

转反义硫氧还蛋白基因小麦萌发种子中蛋白质的变化(英文)

硫氧还蛋白h(thioredoxin h,Trxh)是一类广泛存在于生物体内的多功能活性蛋白,分子量约为12kD,它通过还原靶蛋白中的二硫键参与酶活性调节、抗胁迫、信号传导等许多重要的生命活动。硫氧还蛋白h能促进谷物类种子萌发过程,主要表现在以下2个方面:(1)在籽粒萌发期间,硫氧还蛋白可通过还原储存蛋白的分子内二硫键使其更易于被降解;(2)硫氧还蛋白也可以直接地通过将酶还原或者间接地通过使酶抑制蛋白失活而激活酶。源于Phalaris coerulescens的trxs基因(thioredoxin s,trxs)与小麦硫氧还蛋白h基因(thioredoxin h,trxh)同属于硫氧还蛋白基因家族,它们的cDNA有94%的同源性,表达产物也有相似的生物功能。我们采用基因枪法将反义trxs基因导入小麦,获得了可稳定遗传的小麦,并检测出转基因种子中硫氧还蛋白h表达量、水溶蛋白和醇溶蛋白的还原状态以及a-淀粉酶活性均低于对照小麦;另外,通过模拟降雨抗穗发芽试验证实转基因株系具有很强的抗穗发芽能力。以转反义trxs基因抗穗发芽小麦为材料,检测反义trxs基因小麦籽粒萌发过程中蛋白质的变化,探讨转反义trxs基因小麦的抗穗发芽机理。研究表明反义trxs基因能够减缓KCl可溶性蛋白中Chloroform-methanol(CM)蛋白向代谢类蛋白的转化进程,在萌发初期降低籽粒代谢类蛋白的含量,使籽粒代谢速度下降,而CM蛋白主要包含一些分子量小于20kD的蛋白质。在籽粒成熟过程中,硫氧还蛋白能够阻止麦谷蛋白亚基形成谷蛋白聚合体的过程,在转基因小麦中麦谷蛋白更易于形成大分子量的谷蛋白大聚合体,使得转基因小麦中的谷蛋白在萌发初期更难于被水解,因此转基因小麦籽粒会因谷蛋白难于降解而萌发较慢。另外,反义trxs基因减慢了麦胚中10kD蛋白的降解过程。

转反义Trxs基因小麦灌浆期内源Trxh基因表达及淀粉酶活性的研究

为了进一步揭示反义Trxs基因在抗穗发芽小麦中的作用机理,以转反义Trxs基因的T4代转基因株系（以豫麦70为受体）为材料,运用RT-PCR检测和酶活性测定方法,对其灌浆过程中硫氧还蛋白h（Trxh）基因在不同水平上的表达方式以及α-淀粉酶活性进行了检测。结果表明,转基因小麦籽粒中内源Trxh基因mRNA转录量、Trxh硫氧还蛋白h活性和α-淀粉酶活性均显著低于未转基因的,平均分别比未转基因籽粒下降了21.1%,23.2%和12.6%。其中,花后25-30 d抑制作用最大。回归分析表明,Trxh基因表达量与Trxh活性、α-淀粉酶活性均呈极显著或显著正相关。说明反义Trxs基因的导入干扰或部分抑制了小麦内源同源基因的表达,致使Trxh表达量减少,Trxh活性降低,从而导致了α-淀粉酶活性的降低。