共表达TrxA和DsbC对富含二硫键的异源蛋白在大肠杆菌中表达的影响

以复制子为p15A的质粒pACU184为基础 ,构建了 3种表达硫氧还蛋白 (TrxA)或 和二硫键异构酶 (DsbC)的表达质粒 .经IPTG诱导 ,克隆的DsbC和TrxA都以可溶的形式高表达 .分别将构建的 3种表达质粒与复制子为colE1并克隆有人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶融合基因 (C6 UK)的表达质粒共转化大肠杆菌XL1 blue ,在 30℃用IPTG诱导表达 .SDS PAGE显示 ,共表达TrxA或DsbC都能导致C6 UK融合蛋白的部分可溶性表达 ,而且同时共表达TrxA和DsbC 2种分子时 ,C6 UK完全以可溶形式表达 ,但表达量降低 .分别用溶圈法和ELISA检测了各种共表达时可溶表达产物的生物活性 .结果显示 ,只有共表达DsbC时才能检测到明显的C6

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxAIκBα融合蛋白的制备

目的 利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒 ,制备TrxA IκBα融合蛋白 ,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体。方法 以重组质粒pGEM T IκBα为模板 ,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA ,经相应酶切后插入原核表达载体pET 32a(+)。重组表达质粒pET32a(+) IκBα转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达TrxA IκBα融合蛋白。Westernblot试验鉴定表达蛋白。超声波破菌后采用Ni NTA树脂对TrxA IκBα融合蛋白进行纯化。结果 酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET 32a(+)。重组表达质粒pET32a(+) IκBα在大肠杆菌BL2 1(DE3)中成功地表达了TrxA IκBα融合蛋白 ,其相对分子质量(Mr)约为 5 6× 10 3 ,表达量约占细菌总蛋白的 2 5 %。Westernblot试验显示TrxA IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应。经Ni NTA树脂纯化后 ,TrxA IκBα融合蛋白的纯度可高达 95 %以上。结论 人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础。

蚓激酶基因F238在大肠杆菌中的可溶性表达

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因F238,并将其克隆至大肠杆菌质粒pFT22bTrxA中,构建双顺反子表达载体pTrx-F238。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0mmol/LIPTG、30℃条件下诱导6h,经SDS-PAGE证实蚓激酶成熟肽蛋白获得了高效表达,所表达的蛋白产物相对分子量与预期的26kDa相符,且都是可溶性蛋白,表明分子伴侣TrxA起到了帮助目的蛋白正确折叠的作用。利用血纤维蛋白法对产物活性进行了测定,确定其不仅具有激酶作用,而且具有直接溶栓活性。最高活力可达180U/mL(尿激酶单位)。

空肠弯曲菌黏附蛋白(PEB1)基因工程疫苗外周神经安全性的实验研究

目的以空肠弯曲菌(campylobacterjejuni,CJ)菌体全抗原为对照,以基因重组的该菌融合黏附蛋白(TrxA/PEB1)作为CJ疫苗免疫大鼠,并对其神经安全性进行实验性评价。方法分别以纯化的TrxA/PEB1和CJPen19菌体全抗原经全身免疫增强法免疫大鼠,初次免疫后第2、4、5周采用ELISA法动态观察抗体滴度,并分别于第3、5周分离坐骨神经原纤维及行甲苯胺蓝染色光镜观察。采用ELISA法检测第5周抗血清与GM1抗原的结合反应。神经外膜下注射抗TrxA/PEB1和抗CJ全菌抗原的特异性抗血清,观察其神经病理学改变。结果(1)经两种抗原免疫后,大鼠均产生高滴度特异性IgG,且各自与两种抗原发生交叉反应;(2)以CJPen19全抗原免疫后抗血清可与GM1抗原结合,而TrxA/PEB1免疫者则否;(3)CJPen19免疫组有60%大鼠坐骨神经出现以轴索变性为主的免疫性损伤,而TrxA/PEB1融合蛋白免疫者则未发生;(4)CJPen19免疫血清神经外膜下注射后全部大鼠均发生轴索变性为主的病变,且75%为显著病变,而TrxA/PEB1免疫血清外膜下注射后却未引起明显病变。结论CJPen19全菌抗原和TrxA/PEB1纯化蛋白作为免疫原均可激发大鼠有效体液免疫应答,但与CJ全菌抗原相比,TrxA/PEB1蛋白所产生的全身免疫反应未引起周围神经损伤,其抗血清不含针对GM1抗原的抗体。

重组人IFNα-2b融合表达及纯化工艺研究

为了利用多分子伴侣表达载体在大肠埃希氏菌中融合表达人干扰素（IFNα）-2b，并进行IFNα-2b纯化工艺研究，试验采用人工设计并合成Smt3-IFN（x-2b克隆至自行构建的P32-TrxA载体中，将重组表达质粒P32-TrxA—Smt3-IFNα-2b转化至大肠埃希氏菌（E．coil）BL21（DE3），经IPTG诱导表达、SDS—PAGE分析，在此基础上利用金属螯合层析、SUMO蛋白酶酶切、阴离子交换层析以及凝胶层析建立了IFNot-2b的纯化工艺。结果表明：重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确；融合蛋白分子质量约为40ku，主要以可溶形式表达，表达量占菌体总蛋白的30％以上；纯化的IFNα-2b分子质量约为17ku，蛋白纯度达到95％以上，利用细胞病变抑制法测得干扰素的效价为1．0×10^8IU／mg。说明成功在大肠埃希氏菌中表达并经过简易工艺纯化了重组蛋白IFNα-2b。