绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu的精细定位

黄瓜果实果瘤性状是非常重要的农艺性状,以黄瓜(Cucumis sativus L.)华北有瘤品系S52(P1)和欧洲无瘤品系S06(P2)为亲本,构建826株F2(S06×S52)群体为试验材料,对黄瓜果瘤基因Tu进行精细定位研究。田间调查和遗传分析发现F2群体的果实表现型为有果瘤与无果瘤,卡方值(χ2=0.583<3.84)检验表明其分离比符合3∶1,表明黄瓜果瘤性状是单基因控制的显性性状。早期研究中Tu基因被初步位于第5染色体的标记SSR16203和C_SC933之间,本研究利用公布的黄瓜基因组序列在这两标记之间设计了100对SSR引物,通过分析在两亲本的多态性,最后筛选得到4对SSR多态性标记。然后利用SSR16203和C_SC933标记和这4个多态性引物对826株F2群体进行进一步交换单株分析,最后将Tu基因定位于两翼标记SSR7和SSR18之间,剩余的交换单株分别为11株、16株,物理距离为263kb。经过FGENESH基因预测软件(http:∥www.softberry.com)分析,该区间仅含有候选基因31个。本研究为进一步果瘤基因Tu的最后克隆提供良好的研究基础。

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat^r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat^r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。

小麦蓝矮病植原体延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列的同源性分析

目的利用分子生物学方法分析小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因,从亚组水平上确定小麦蓝矮病植原体的分类地位。方法电镜观察自然发病的小麦蓝矮病病叶;用引物fTufu/rTufu对小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因进行PCR扩增;核苷酸序列测定及分析。结果经电镜超微结构观察,在韧皮部观察到大量典型植原体。通过PCR扩增得到约850bp的特异片段。感受态转化后,进行测序,结果表明小麦蓝矮病植原体tuf基因片段长842bp,编码280个氨基酸。分析比较15种植原体延伸因子tuf基因的同源性,结果表明小麦蓝矮病植原体与三叶草绿变(KVF)亲缘关系最近,核苷酸同源性为99.9%,氨基酸同源性为100%。结论从亚组水平上确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位,为研究小麦蓝矮病植原体的来源及致病分子机理提供理论依据。

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化

为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(Tu)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究。使用限制性内切酶KpnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体。通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率。580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37%。

耐热蛋白质延长因子(EF-Tu)的分子和功能的性质(英文)

本文用亲和层析法从Calderobacteriumhydrogenophilum(极端耐热细菌)中分离得到纯的耐热蛋白质延长因子。测得其相对的分子量为51000。该蛋白质对热极其稳定,从膜过滤分析法测定EF-Tu 的活性可知,在80℃加热5 min后,原活性仅仅失去50%。Ouchterlony双向免疫扩散的结果表明,该蛋白延长因子与E.coli 延长因子有着抗原的相似性。而且该因子只含一个半胱氨酸残基,其位置在半胱氨酸81,即肽段T_(13)。Southern 杂交试验的结果显示出C.hydrogenophilum 的染色体DNA 中可能有两个基因编码同一蛋白。

绵羊肺炎支原体延伸因子Tu基因的分子特性分析

对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)参考菌株Y98株和11个临床分离株的tuf基因进行克隆、测序,生物信息学分析及构建进化树,分析绵羊肺炎支原体tuf基因的分子结构特性。结果表明:Y98株和11株分离株tuf基因编码区全长1 209bp,编码402个氨基酸,氨基酸相似性为93.3%~100%,有较高的抗原指数和抗原表位,不含信号肽,平均GC含量为39.80%。Y98株与10个分离株延伸因子Tu存在1个跨膜区,含有6种不同的功能位点。而一分离株该蛋白质存在2个跨膜区,在271—274位点多出1个N-糖基化位点。12个菌株的tuf基因有117个单核苷酸突变位点,其中无义突变为41个,有义突变为76个,造成53个推导的氨基酸变化,主要发生在325—354位点靠近羧基端,有可能导致该蛋白质功能的改变。基于该基因的遗传进化与全基因组建立的进化关系一致,比16SrRNA基因更适合作为绵羊肺炎支原体进化关系的分子靶标。该基因种内保守同时也存在遗传多样性,作为分子分型的潜力值得进一步研究。

滑液囊支原体贵州株膜蛋白EF-Tu、pdhβ免疫原性分析

为了研究鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)膜蛋白EF-Tu和pdhβ的免疫应答效果,试验针对目的基因设计特异性引物,经PCR扩增并构建原核表达载体,应用相关软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,对目的蛋白进行诱导表达并进行动物免疫试验。结果表明:PCR扩增EF-Tu和pdhβ基因得到特异性条带,大小为1185 bp和993 bp;成功构建了重组质粒pET32a-EF-Tu和pET32a-pdhβ;滑液囊支原体贵州分离株(MS-GZ-ZJ株)同其他流行株的EF-Tu基因同源性在99.7%~100%之间,pdhβ基因同源性在99.6%~100%之间,说明MS-GZ-ZJ株EF-Tu、pdhβ基因高度保守;EF-Tu、pdhβ蛋白的分子质量分别为43 ku和35 ku,是稳定的亲水蛋白;EF-Tu蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链为主,pdhβ蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。表达的蛋白大小与预期相符,EF-Tu蛋白主要为可溶性表达,pdhβ蛋白主要为包涵体表达;EF-Tu、pdhβ重组蛋白均能与MS阳性血清特异性结合。EF-Tu重组蛋白不能单独诱导细胞免疫应答,而pdhβ重组蛋白能刺激鸡群产生少量的白细胞介素4(IL-4),两个重组蛋白混合能诱导少量的IL-2和IL-4,但比疫苗组低很多;体液免疫应答效果不明确。说明单独使用经预测免疫原性好的蛋白质不一定能诱导动物机体产生良好的反应原性。

基于TU基因的牛支原体感染病例实验室快速检测

牛支原体是一种主要引发牛呼吸系统症状为主的病原,鉴于其所致病例临床病变与我国已消灭疫病牛肺疫非常相似,该类疫病的快速鉴别诊断非常重要。实验针对贵州省疑似牛肺炎病例进行快速病原检测与目的基因序列分析,结果显示,从临床病例组织样本中扩增到大小约265 bp的TU基因目的片段,与预期结果相符;序列测定与分析显示,所扩增TU基因序列与牛支原体国内外分离株序列同源性高、亲缘关系近。实验结果表明,本次疫情为牛支原体感染所引起,为疫病防控提供了确切诊断信息。

IRF2BP2及融合基因在实体肿瘤发生发展中作用的研究进展

干扰素调节因子2结合蛋白2(IRF2BP2)作为新型转录调节因子,是干扰素调节因子2结合蛋白(IRF2BP)转录调节家族中的重要成员之一。IRF2BP2广泛存在于不同生物体中,充当着正负反馈调节器的角色,参与细胞功能的调节,如细胞凋亡、细胞增殖、细胞免疫等,从而调节肿瘤微环境,影响着肿瘤的发生发展。同时,IRF2BP2基因还可以和其他类型基因发生基因融合,成为IRF2BP2/NTRK1、IRF2BP2/CDX1、IRF2BP2/RARA等,共同影响肿瘤的发生发展。

链球菌SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法的建立

为建立链球菌的快速定量检测方法,本研究根据链球菌延伸因子EF-Tu基因保守序列设计一对引物,以链球菌DNA为模板通过PCR扩增其197 bp的EF-Tu基因片段,并克隆至p MD18-T载体中。以纯化的重组质粒为标准品建立标准曲线,建立了链球菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示在3.98×106拷贝/m L^3.98×102拷贝/μL范围内具有较好的线性关系,相关系数为R2=0.995,最低检出量为39.8拷贝/μL。此外,该方法具有良好的特异性,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等其他细菌的检测结果均为阴性。重复性试验表明,该方法的组内和组间变异系数均低于1.0%。利用该方法对34份疑似链球菌感染病料进行检测,结果显示本研究所建立的方法对链球菌的检出率比常规PCR高14.7%,比细菌分离鉴定方法高29.4%。表明该方法可以用于对链球菌感染的定量研究和流行病学调查。

水稻转高赖氨酸蛋白质基因(sb401)植株的获得及种子中蛋白质和氨基酸的含量分析

用来源于马铃薯花粉的高赖氨酸蛋白质基因和玉米醇溶蛋白基因启动子构建了一个植物表达载体。采用农杆菌介导法导入籼稻品种龙特甫B ,PCR和Southernblot结果表明外源基因已整合到水稻基因组中,Westernblot分析表明高赖氨酸蛋白质基因已在转基因水稻种子中表达。对7株转基因水稻种子的分析表明,蛋白质的含量(10 . 87%～13. 16 % )平均提高了18. 7% ,赖氨酸的含量(0 . 4 7%～0 . 6 0 % )平均提高了10 % ,苏氨酸的含量(0 . 4 2 %～0 . 5 3% )平均提高了15 . 71% ,苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸等必需氨基酸的含量也均有不同程度的提高。

PCR直接测序方法及其在肿瘤研究中的应用

ＰＣＲ直接测序技术是ＰＣＲ扩增与核酸测序技术相结合的一种方法。根据此技术的原理，建立了一种以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，α￣（－３５）ＳｄＡＴＰ直接掺入，ＴａｑＤＮＡ聚合酶直接测序ＰＣＲ扩增产物的方法。实验表明：该方法简便、快速、稳定。用此方法对人食管癌组织中的抗癌基因ｐ５３进行了突变测序分析，发现食管癌组织中ｐ５３存在点突变，插入、丢失移码突变。并用此方法对人和恒河猴的ｐ５３内含子序列进行了测定，发现猴第５内含子为８１个核苷酸，第８内含子为９２个核苷酸。

青海土族、撒拉族HLA-DQA1和-DQB1基因多态性探讨

目的 :检测青海土族和撒拉族健康个体HLA DQA1和 DQB1等位基因频率 ,了解和分析这两个民族的HLA DQA1和 DQB1基因多态性。方法 :用PCR SSO方法检测 132名土族和 80名撒拉族健康个体的HLA DQA1和 DQB1的基因多态性 ,并将所得结果与国内其他民族的同类资料进行比较。结果 :土族和撒拉族在HLA DQA1和 DQB1高频率等位基因分布上有共同点 ,也有一定的独特性。这两种民族HLA DQA1 0 10 2和 0 5 0 1以及DQB1 0 2 0 1、 0 30 1、 0 4 0 2和 0 6 0 2基因分布频率上具有显著性差异。结论 :土族和撒拉族与北方诸民族的等位基因频率接近 ,而与其他南方诸民族的差异相对较大。

hPTTG1在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的:检测人垂体瘤转化基因1(hPTTG1)在结直肠癌中的表达,分析其与临床病理参数之间的关系,为阐明hPTTG1在结直肠癌诊断和转移复发中的临床价值提供实验依据.方法:收集我院2004-01/2006-09结直肠癌及对应癌旁组织的手术标本60例.采用免疫组织化学和Western blotting检测结直肠癌组织与对应癌旁组织hPTTG1蛋白的表达,并探讨其与临床病理指标的关系.结果:60例结直肠癌组织有56例表达hPTTG1蛋白,阳性率为93.3%,而癌旁组织hPTTG1仅8例表达,且均为弱阳性,阳性率为13.3%(χ2=77.13,P<0.001).hPTTG1表达与血清CEA水平具有显著相关,血清CEA大于5mg/L较小于5mg/L显著增高(χ2=30.886,P<0.001).hPTTG1在DukesC、D期显著高于DukesA、B期(χ2=9.87,P<0.001).伴有淋巴转移、肝转移或其他器官转移者较无转移者显著增高(χ2=9.87,P<0.001).hPTTG1与患者的性别、年龄、肿瘤直径大小和病理分型无关.结论:hPTTG1在结直肠癌中高表达,与结肠癌的疾病进展密切相关,检测hPTTG1有助于患者预后的判断.

RB基因与肿瘤抑制

ＲＢ基因位于１３ｑ１４，全长１５０ｋｂ，编码一个由９２８个氨基酸组成的分子量为１１００００蛋白（ｐｐ１１０ＲＢ）．它能特异性与ＳＶ４０大Ｔ，Ｅ１Ａ和Ｅ７结合．在视网膜细胞中，ＲＢ呈衡定组成性表达。

纳洛酮对创伤性脑损伤患者血浆ET,CGRP,S-100B含量的影响

【目的】观察纳洛酮对创伤性脑损伤 (TBI)患者血浆内皮素 (ET)、降钙素基因相关肽 (CGRP)、神经组织蛋白 (S 10 0B)含量的影响 ,探讨纳洛酮对急性TBI患者的治疗效果。【方法】用放射免疫测定法测定TBI患者血浆ET 1、CGRP的含量变化 ,用酶联免疫吸附实验测定S 10 0B的含量变化。【结果】①脑损伤后患者血浆ET 1(d1、d3 、d5)明显升高 ,病情越重升高越明显 ;②纳洛酮治疗后血浆ET 1含量下降较对照组显著 ,CGRP早期 (d1)较对照组明显升高 ;③TBI患者血浆中脑损伤特异性蛋白S 10 0B明显升高 ,脑损伤程度越重 ,升高越明显。【结论】①TBI患者血浆ET 1及S 10 0B水平升高 ,与病情严重程度有关。②ET、CGRP平衡失调在TBI的病理过程中起到重要作用。③早期应用纳洛酮可以显著降低ET 1及S 10 0B血浆含量 ,提高CGRP水平 。

血必净联合纤维支气管镜吸痰灌洗治疗重症肺炎的疗效及对血清炎性因子水平的影响

目的探讨血必净联合纤维支气管镜吸痰灌洗治疗重症肺炎病人的疗效及对血清炎性因子水平的影响。方法将周口市中心医院呼吸重症监护病房2018年3月至2019年2月收治的104例重症肺炎病人按随机数字表法分为对照组(n=50)和试验组(n=54),对照组应用纤维支气管镜吸痰灌洗,试验组给予血必净+纤维支气管镜吸痰灌洗治疗,比较两组治疗后疗效、机械通气时间、抗菌药物治疗使用时间、肺啰音消失时间、ICU住院时间,治疗前后氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)、血氧饱和度(SpO2)和血清肿瘤坏死因子 a(TNF α)、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)水平等。结果治疗7 d后,试验组总体疗效优于对照组(P<0.05);治疗后,试验组机械通气时间(6.19±1.39)d、肺啰音消失时间(6.28±1.49)d、抗菌药物治疗使用时间(5.93±1.32)d和ICU住院时间(13.19±2.49)d显著短于对照组的(9.26±1.39)d、(10.24±2.20)d、(9.62±1.54)d、(17.84±3.24)d(P<0.05);治疗前两组PaCO2、PaO2、SpO2及血清TNF α、PCT、CRP水平组间比较均差异无统计学意义(P>0.05),治疗后试验组PaO2(83.24±6.50)mmHg、SpO2(93.16±7.29)%高于对照组的(73.53±5.76)mmHg、(84.62±6.82)%,PaCO2(43.07±3.61)mmHg和血清TNF α(51.29±6.68)ng/L、PCT(0.59±0.13)pg/L、CRP(23.66±3.06)mg/L水平低于对照组的(47.27±3.82)mmHg、(65.34±7.12)ng/L、(1.38±0.39)pg/L、(41.63±5.18)mg/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血必净联合纤维支气管镜吸痰灌洗可降低重症肺炎机体炎症反应程度,改善血气分析指标,缩短ICU住院时间,提高临床疗效。

青海土族人群HLA-A、B、DRB1基因多态性分析

目的:分析青海土族人群人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)A、B、DRB1的基因多态性特点。方法:应用聚合酶链反应-直接测序分型(Polymerase chain reaction sequence-based typing,PCR-SBT)法对土族人群中47名健康无血缘关系的个体进行HLA-A、B、DRB1基因座高分辨分型。并将青海土族人群的HLA-DRB1基因与国内其它少数民族人群进行比较。结果:检出HLA-A、B、DRB1的基因型数和等位基因数分别为34、41、42和17、28、30。这3个基因座分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。且HLA-DRB1基因座等位基因频率分布与蒙古族有相似之处,表现在基因频率较高的DRB1*04,DRB1*07,DRB1*09,DRB1*12等位基因。结论:青海土族人群具有独特的HLA-A、B、DRB1基因频率分布特征,且青海土族HLA-DRB1等位基因频率分布与蒙古族有相似之处。

沉默间皮素基因对逆转卵巢癌SKOV3/cDDP细胞株顺铂耐药的影响

【目的】探讨沉默间皮素(MSLN)基因对逆转卵巢癌顺铂(cDDP)耐药细胞株SK0V3/cDDP的影响。【方法】分别采用荧光定量PCR和Western blotting方法检测SKOV3/cDDP细胞及SKOV3细胞中MSLN mRNA和MSLN蛋白表达水平。分别用MSLN RNAi慢病毒液、空载体慢病毒液转染SKOV3/cD-DP细胞,建立稳定感染的细胞株SKOV3/cDDP-LV-MSLN-RNAi(实验组)和SKOV3/DDP-MSLN-neg(阴性组)。分别应用MTT法和FCM检测转染后耐药细胞对cDDP的敏感性及cDDP诱导的细胞凋亡情况。【结果】SKOV3/cDDP细胞MSLN mRNA和MSLN蛋白的表达水平明显高于敏感SKOV3细胞(P<0.01);转染间皮素RNAi慢病毒液的细胞MSLN蛋白的表达量明显低于空栽体慢病毒液转染的细胞和未进行任何转染操作的细胞,且差异有显著性(P<0.01)。实验组细胞的半数抑制浓度(IC50)值明显低于阴性组和空白组(P<0.01);实验组SKOV3/cDDP-LV-MSLN-RNAi细胞凋亡率明显高于阴性组和空白组(P<0.01)。【结论】MSLN沉默可增强卵巢癌SKOV3/cDDP细胞对cDDP的敏感性,促进cDDP诱导的卵巢癌耐药细胞凋亡,在一定程度上可逆转卵巢癌SKOV3/cDDP细胞株顺铂耐药。