人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系。方法采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定。利用电穿孔方法将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果和原始序列相同。重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/m。l结论成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系。

重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE30中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行TricineSDSPAGE电泳分析和WesternBlot检测分析.结果构建了重组融合表达质粒pQE30Tum5,表达的蛋白经TricineSDSPAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.

Tumstatin基因抗肿瘤血管生成片段Tum-5的研究进展

本文就肿瘤抑素(Tumstatin)抗血管生成活性片段Tum-5的相关研究进展做一综述。

PcDNA3.1-Tum-5基因真核表达载体的构建

目的构建携带Tum-5基因真核表达载体PcDNA3.1-Tum-5。方法利用巢式PCR扩增人胚肾细胞株HEK293 cDNA获得Tum-5基因,并利用DNA回收试剂盒进行回收;同时扩增、提取pcDNA3.1质粒,并将其与Tum-5基因分别进行EcoRV和XhoI双酶切,回收相应条带,通过T4DNA连接酶进行连接,转化DH5α感受态细胞,获得阳性克隆。获得质粒DNA后行KpnI和XhoI双酶切,克隆并测序酶切产物。结果巢式PCR扩增出的产物与目的基因大小相同;重组质粒经双酶切电泳分析,与预期结果一致;对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确,插入序列与载体读码框架相匹配。结论本方法可以成功构建人Tum-5基因表达载体,为进一步研究Tum-5基因功能提供了理论依据。

长双歧杆菌分泌型表达载体的构建及Tum-5基因的表达

目的构建能在双歧杆菌内稳定存在并高效分泌表达外源基因的长双歧杆菌质粒表达载体。方法以质粒p BAD/glll为基础,以双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的分泌性信号肽取代质粒原有的分泌性信号肽,并将双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因克隆入载体中,构建表达载体p BBADs。将人Tum-5基因克隆入载体中,构建质粒p BBADs-Tum-5,电转化长双歧杆菌NCC2705,L-阿拉伯糖诱导表达后,Western Blot鉴定基因表达。结果成功地构建了长双歧杆菌分泌型质粒表达载体,Tum-5基因在双歧杆菌内可以表达。结论构建的表达载体为双歧杆菌用于肿瘤靶向基因治疗奠定了基础。

pLXSN-Tum-5致人脐静脉内皮细胞凋亡作用及机制

目的探讨pLXSN-Tum-5病毒颗粒对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长抑制和诱导凋亡作用及机制。方法采用不同浓度的pLXSN-Tum-5病毒颗粒作用HUVEC,利用噻唑蓝法和Hoechst-33342染色法检测细胞生长及其形态变化;RT-PCR和Western blotting方法检测细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA和蛋白表达变化。结果与对照组(pLXSN)比较,pLXSN-Tum-5病毒颗粒转染组HUVEC的存活率明显降低,呈剂量效应关系;细胞内可见凋亡小体;对照组HUVEC内Bcl-2和caspase-3 mRNA和蛋白表达分别为(0.721±0.041)、(0.654±0.034)和(0.956±0.032)、(0.356±0.054);与对照组比较,20μmol/L pLXSN-Tum-5病毒颗粒转染组HUVEC内Bcl-2和caspase-3mRNA和蛋白水平[分别为(1.134±0.0524)、(1.012±0.0641)和(1.612±0.067)、(0.712±0.0647)]明显上调(P<0.05)。结论 Tum-5可抑制HUVEC增殖,诱导HUVEC凋亡,其机制可能与上调Bax/Bcl-2和caspase-3表达有关。

重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌DH5α生产rNGR-Tum-5,研究了培养基中不同种类的碳氮源物质和微量元素对工程菌生产蛋白能力的影响。得出在培养基组分(%)为:甘油1,酵母粉3,蛋白胨1,氯化钠0.5,微量元素母液150μ时,重组大肠杆菌DH5α生产rNGR-Tum-5最强,较初始培养基提高了5倍。